自噬是近年來(lái)很熱門(mén)的領(lǐng)域

1、自噬是近年來(lái)很熱門(mén)的領(lǐng)域，搜了一下園子，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有這方面系統(tǒng)的介紹或討論，但很多戰(zhàn)友有這方面的疑問(wèn)，加上本人最近對(duì)此也非常感興趣，因此，借本版來(lái)專(zhuān)門(mén)討論一下自噬（說(shuō)實(shí)在的，自噬屬于丁香園哪一個(gè)版塊的范圍我也選不好），與各位同行或有志于研究自噬的戰(zhàn)友共同學(xué)習(xí)，也歡迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流。自噬相關(guān)文獻(xiàn)的全文納米盤(pán)下載key：123內(nèi)容：1） 什么是自噬？包括自噬的定義、形態(tài)學(xué)特征、分子基礎(chǔ)、調(diào)控等2）自噬的意義自噬與細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、疾病、衰老等的關(guān)系3）怎么研究自噬？主要談?wù)勗趺醋C明細(xì)胞發(fā)生了自噬，即自噬的判斷標(biāo)準(zhǔn)和各種研究自噬的方法及局限性。最詳細(xì)的介紹：Madame Cur

2、ie Bioscience Database /books/bv.fcgi?rid=eurekah.chapter.24952透射電鏡下自噬的照片：自噬的特性： 1）自噬是細(xì)胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎對(duì)細(xì)胞不利。事實(shí)上，細(xì)胞正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。這些誘發(fā)因素很多，也是研究的熱門(mén)。既有來(lái)自于細(xì)胞外的（如外界中的營(yíng)養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長(zhǎng)因子的濃度等），也有細(xì)胞內(nèi)的（代謝壓力、衰老或破損的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤或聚集的蛋白質(zhì)等）。由于這些因素的經(jīng)常性存在，因此，細(xì)胞保持了一種很低的、基礎(chǔ)的

3、自噬活性以維持自穩(wěn)。2）自噬過(guò)程很快，被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別5）“捕獲”胞漿成分的非特異性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特異性不是首先考慮的，這與自噬的應(yīng)急特性是相適應(yīng)的。6）自噬的保守性：由于自噬有利于細(xì)胞的存活，因此無(wú)論是物種間、還是各細(xì)胞類(lèi)型之間（包括腫瘤細(xì)胞），自噬都普遍被保留下來(lái)（誰(shuí)不喜歡留一手呢？）。參考綜述：Autophagy fights disease through cellular self-digestion.pdf自噬相關(guān)基因（autophagy associ

4、ated gene, ATG）：在自噬過(guò)程中到底有哪些蛋白的參與，即自噬相關(guān)蛋白的鑒定是目前自噬研究主要的任務(wù)。由于自噬研究的歷史關(guān)系，很多基因在酵母和哺乳動(dòng)物中有不同的命名。在/books/bv.fcgi?rid=eurekah.table.24964中介紹了一些較早發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因，下面列出幾個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的：1）bif-1（又叫Endophilin B1） 和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene） 相關(guān)文章：Bif-1 interacts with B

5、eclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis.pdf2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）相關(guān)文章：The Pancreatitis-induced Vacuole Membrane Protein 1 Triggers Autophagy in Mammalian Cells.pdf3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）相關(guān)文章：DRAM, a p53-Induced Modulator of Autophagy, Is Cri

6、tical for Apoptosis.pdf4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）相關(guān)文章：The TP53INP2 Protein Is Required for Autophagy in Mammalian Cells.pdf自噬過(guò)程的調(diào)控：從上面總結(jié)的自噬特點(diǎn)中可以看出，自噬這一過(guò)程一旦啟動(dòng)，必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止，否則，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們?cè)谘芯孔允蓵r(shí)一定要?jiǎng)討B(tài)觀察，任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評(píng)價(jià)自噬的活性。目前，已經(jīng)報(bào)告了很多因素能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，如饑餓、

7、生長(zhǎng)因子缺乏、微生物感染、細(xì)胞器損傷、蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等，這么多刺激信號(hào)如何傳遞的、哪些自噬蛋白接受信號(hào)、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等很多問(wèn)題都還在等待進(jìn)一步解答中。關(guān)于傳遞自噬信號(hào)的通路目前比較肯定的有：抑制類(lèi)1）Class I PI3K pathway （PIphosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）與IRS (Insulin receptor substrate) 結(jié)合，接受胰島素受體傳來(lái)的信號(hào)（血糖水平高抑制自噬）詳細(xì)介紹參見(jiàn)：維基百科 /wiki/Phosphoinositide_3-kina

8、se2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）mTOR在人類(lèi)中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶。能接受多種上游信號(hào)，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受營(yíng)養(yǎng)和能量的變化。 詳細(xì)介紹見(jiàn)：/wiki/MTOR激活類(lèi)1）Class III PI3K結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于Class I PI3K，但作用相反。接受上述信號(hào)的自噬蛋白：目前都把焦點(diǎn)集中在becli

9、n 1（酵母同源物為atg6），能與多種蛋白結(jié)合，如Vps34（Class III PI3K的催化亞單位），mTOR，BCL-2和BCLXL蛋白等，更多介紹請(qǐng)參閱OMIM：/entrez/dispomim.cgi?id=604378。在【動(dòng)態(tài)版】需注意的是，beclin-1是一個(gè)多功能蛋白，除了接受自噬信號(hào)，它還可以接受很多其它的信號(hào)對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，beclin-1可能是自噬的“守門(mén)人”。自噬體的發(fā)生：目前認(rèn)為，自噬體的膜不是直接來(lái)源于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而是在胞漿中重新生成的，但具體的機(jī)制尚不清楚。當(dāng)beclin-1被活化

10、后，胞漿中先形成很多個(gè)membrane source（自噬體膜發(fā)生中心），在它們不斷擴(kuò)展的過(guò)程中（phagophore到autolysosome），VMP1蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)位到自噬體膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一與自噬有關(guān)的跨膜蛋白），同時(shí)，MAP1-LC3由胞漿型（即LC3-I）轉(zhuǎn)位到自噬體膜（即LC3-II），LC3這一轉(zhuǎn)變過(guò)程可被Western Blot和熒光顯微鏡檢測(cè)到，現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。（更新中。）自噬與腫瘤的關(guān)系：與凋亡（在腫瘤細(xì)胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被優(yōu)先保留的。無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的。因

11、為細(xì)胞中隨時(shí)產(chǎn)生的“垃圾”（破損或衰老的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、錯(cuò)誤合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等等）都需要及時(shí)清除，而這主要靠自噬來(lái)完成，因此，自噬具有維持細(xì)胞自穩(wěn)的功能；如果將自噬相關(guān)基因突變失活，如神經(jīng)元會(huì)發(fā)生大量聚集蛋白，并出現(xiàn)神經(jīng)元退化。同時(shí)，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物，可以說(shuō)，自噬就是一個(gè)“備用倉(cāng)庫(kù)”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會(huì)餓死。更重要的是，自噬活性可在代謝應(yīng)激（饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏、射線、化療等）時(shí)大大增強(qiáng)，表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體，這一現(xiàn)象被稱為“自噬潮”（autophagic flux），廣泛用于自噬形成

12、的監(jiān)測(cè)。自噬潮為細(xì)胞度過(guò)危機(jī)提供了緊急的營(yíng)養(yǎng)和能量支持，有利于細(xì)胞的存活。鑒于自噬的上述作用，自噬可為腫瘤細(xì)胞帶來(lái)幾大好處：1）腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點(diǎn)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長(zhǎng)大發(fā)生血管崩塌時(shí)、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時(shí)等都會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷，而此時(shí)提高自噬活性可以有助于度過(guò)這一危機(jī)。2）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，而此時(shí)提高自噬活性可及時(shí)清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時(shí)間和條件。由于自噬減少了腫瘤細(xì)胞在代謝應(yīng)激時(shí)發(fā)生壞死的機(jī)會(huì)，而對(duì)于

13、腫瘤細(xì)胞群體而言，需要一部分細(xì)胞發(fā)生壞死，以引發(fā)適度的炎癥（有利于血管的長(zhǎng)入、吸引免疫細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子等）。研究發(fā)現(xiàn)，很多類(lèi)型的腫瘤在代謝應(yīng)激時(shí)會(huì)“組成性”活化PI3K信號(hào)以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬會(huì)促進(jìn)壞死），但具體機(jī)制尚不清楚。參考文獻(xiàn)：Autophagy and toll-like receptors：A new link in cancer cells.pdfAutophagy fights disease through cellular self-digestion.pdfRole and regulation of autophagy in cancer.pdfRo

14、le of autophagy in cancer.pdfAutophagy and Cell Death： No Longer at Odds.pdfAutophagy and cancer： Dynamism of the metabolism of tumor cells and tissues.pdf（更新中。）自噬與細(xì)胞死亡的關(guān)系：有必要說(shuō)明一下的是，細(xì)胞死亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，為了研究方便，需進(jìn)行分類(lèi)，但我們思考時(shí)不要局限于這些人為的分類(lèi)，而應(yīng)注重于現(xiàn)象本身來(lái)研究其背后的機(jī)制。一直以來(lái)人們從不同角度、用不同方法來(lái)觀察細(xì)胞的死亡，并把細(xì)胞的死亡方式分為2類(lèi)：壞死和凋亡，因?yàn)閮烧哂兄?/p>

15、明顯的區(qū)別，其中最主要的區(qū)別之一就是細(xì)胞膜的通透性壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜喪失了完整性，內(nèi)容物被釋放出來(lái)，染料可自由進(jìn)入細(xì)胞，而凋亡細(xì)胞保持完整，無(wú)內(nèi)容物釋放，染料也被排斥。很多實(shí)驗(yàn)亦根據(jù)這一原理來(lái)設(shè)計(jì)以區(qū)分壞死和凋亡，這將在后面一一介紹，如同剛剛說(shuō)明的那樣，這些實(shí)驗(yàn)只能說(shuō)明細(xì)胞膜的通透性（必要條件，不是充分必要條件），而不能用來(lái)證實(shí)壞死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。一般認(rèn)為壞死是被動(dòng)的，不可控的，而凋亡是主動(dòng)的，可控的。為了強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)，凋亡被定義為程序性細(xì)胞死亡（program cell death，PCD）。但無(wú)論是壞死還是凋亡，都是一個(gè)過(guò)程，是需要時(shí)間的（尤其是凋亡，從啟動(dòng)到完成，細(xì)胞要執(zhí)行很多反應(yīng)），而且細(xì)

16、胞死亡后都有“尸體”。在研究自噬與凋亡的關(guān)系時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體，但這樣的細(xì)胞缺乏凋亡的典型特點(diǎn)，如核固縮（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、細(xì)胞皺縮（shrinkage）、沒(méi)有凋亡小體的形成等，被稱為自噬樣細(xì)胞死亡（autophagic cell death，ACD），它是一種新的細(xì)胞程序性死亡，為了與凋亡區(qū)別，被命名為T(mén)ype II cell death，相應(yīng)的，凋亡為T(mén)ype I cell death，壞死為T(mén)ype III cell death。盡管這樣，但對(duì)于自噬是否是細(xì)胞死亡的直接原因目前還存在很大的爭(zhēng)議。到底是Cell d

17、eath by autophagy（自噬引起死亡）還是Cell death with autophagy（死亡時(shí)有自噬發(fā)生，但不是直接原因）？對(duì)此，自噬研究領(lǐng)域“大?！奔?jí)專(zhuān)家Levine Beth在一篇nature的Review中表達(dá)了自己的觀點(diǎn)。由于在形態(tài)學(xué)上2者無(wú)明顯區(qū)別，但通過(guò)阻斷自噬，觀察細(xì)胞的結(jié)局可區(qū)分開(kāi)來(lái)：Cell death by autophagy細(xì)胞存活，而Cell death with autophagy細(xì)胞死亡。Autophagic cell death： the story of a mis

18、nomer.pdf（更新中。）自噬的研究方法：正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的工具藥有：（一）自噬誘導(dǎo)劑1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）3）Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pat

19、hway抑制劑5）Rapamycin：mTOR抑制劑6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑（二）自噬抑制劑1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑2）Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲?。?xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的策略和技術(shù)有：1

20、）觀察自噬體的形成由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月?tīng)罨虮瓲睿p層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：?jiǎn)螌幽?，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來(lái)示蹤自噬形成：由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自

21、噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。3）利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成：自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。（Note：LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。）4）檢測(cè)長(zhǎng)壽蛋白的批量降解：非特異5）MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺

22、）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。6）CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來(lái)共定位：Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測(cè)自噬體與溶酶體融合。LysoTrackerTM 探針：有紅或藍(lán)色可選，顯示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)），可用來(lái)檢測(cè)線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

23、MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過(guò)固定后還能保留。Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放。Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔【Note：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理】自噬與細(xì)胞死亡經(jīng)常需一起考慮，下面介紹一些檢測(cè)細(xì)胞死亡的方法：（1）m dissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM發(fā)紅色熒光，DiOC6（3）發(fā)綠色熒光。（2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰絲氨酸外翻）：Annexin V-F

24、ITC（綠色）染細(xì)胞膜，（3）檢測(cè)線粒體產(chǎn)生的ROS：無(wú)熒光的HE（hydroethidine，氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），發(fā)紅色熒光。NAO（nonyl acridine orange，烷化吖啶橙，可發(fā)熒光）能與非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反應(yīng)而失去熒光。（4）線粒體IMS蛋白的釋放：AIF，細(xì)胞色素c，分別用熒光二抗染色。（5）Capase 3a 染色：用熒光二抗染色，胞漿彌散分布。（6）細(xì)胞膜完整性檢測(cè)：DAPI（藍(lán)色）、Hoechst 33342或PI（紅色）染核。胞膜完整的細(xì)胞（活細(xì)胞和早中期凋亡細(xì)胞

25、）排斥，可聯(lián)用annexin V。【如何用實(shí)驗(yàn)區(qū)分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy】第一步：利用上述方法證實(shí)細(xì)胞死亡第二步：證實(shí)細(xì)胞死亡前發(fā)生了自噬第三步：在形態(tài)學(xué)上區(qū)別開(kāi)“自噬樣死亡”與凋亡第四步：利用遺傳學(xué)手段（反義RNA干擾Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具藥抑制自噬第五步：細(xì)胞存活則為Cell death by autophagy，反之，細(xì)胞死亡則為Cell death with autophagy。參考文獻(xiàn)：Methods for Assessing Autophagy and Autophagic

26、Cell Death.pdfCytosolic LC3 Ratio as a Sensitive Index of Macroautophagy in Isolated Rat Hepatocytes and H4-II-E Cells.pdfPepstatin A均屬于蛋白酶抑制劑，二者以1：1的比例聯(lián)用可以抑制自噬。有研究表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中聯(lián)用E64d及Pepstatin A，可明顯抑制溶酶體的降解從而阻斷自噬的進(jìn)展，而自噬體的形成并沒(méi)有受到明顯影響。大自噬（Macroautophagy）即我們說(shuō)的自噬（autophagy）微自噬（Microautophagy）：是指溶酶體主動(dòng)、直接吞

27、噬胞漿成分的一種方式。分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侶，如hsc70，能幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體。另外，幾個(gè)與phage相關(guān)的概念：吞噬（phagocytosis）：細(xì)胞主動(dòng)吞掉胞外的細(xì)菌、碎片、或其它細(xì)胞。吞飲（pinocytosis）：胞外的液體異噬（heterophagy）：吞噬、吞飲的統(tǒng)稱，強(qiáng)調(diào)所吞內(nèi)容物來(lái)自細(xì)胞外，它們都是單層膜的液泡。自噬體（autophagosome）形成后，可與吞噬泡或吞飲泡融合，然后再與溶酶體融合，但這一過(guò)程的證實(shí)還需更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)支持。自噬體增多，也就是“自噬潮”出現(xiàn)的原因一是形成增多，二

28、是與溶酶體融合受阻（如使用了氫化氯喹或氯喹，另外，溶酶體的酶抑制劑和質(zhì)子泵抑制劑的使用亦有可能影響溶酶體與自噬體或異噬泡的融合），使自噬體不能降解而積聚，這種積聚造成的自噬體增多的效應(yīng)要大于自噬體誘導(dǎo)劑效應(yīng)的數(shù)倍之多。鑒于這樣的原因，單純的GFP-LC3熒光斑點(diǎn)增多不足以作為自噬激活的證據(jù)，可聯(lián)用多個(gè)方法來(lái)判斷：1）加用自噬體與溶酶體融合的抑制劑，如氯喹，觀察自噬潮的變化。2）或加用LC3和溶酶體示蹤物在熒光顯微鏡下觀察共定位情況。3）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶體膜蛋白）。4）檢測(cè)胞漿長(zhǎng)壽蛋白的降解。Western Blot檢測(cè)LC3時(shí)除了上述的原因外，還有幾個(gè)需考慮到的地方

29、：1）抗體的親和力：有報(bào)道認(rèn)為L(zhǎng)C3抗體對(duì)II型LC3的親和力較高2）結(jié)合于自噬體內(nèi)層膜的LC3-II在與溶酶體結(jié)合后被降解。3）自噬過(guò)程很快，一個(gè)自噬體從產(chǎn)生到降解僅需23個(gè)小時(shí)或更短，其中自噬體形成階段更迅速，數(shù)分鐘即可完成，而溶酶體降解階段耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。因此，設(shè)置多個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（time frame）是非常重要的。自噬現(xiàn)在作為細(xì)胞研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，自然與其特殊的作用有關(guān)，但不能把其作為解決以前不能解決之問(wèn)題的“萬(wàn)金油”，這一傾向在發(fā)現(xiàn)凋亡、miRNA后出現(xiàn)過(guò)。我們有時(shí)候需要跳出這個(gè)圈子來(lái)看圈子里的問(wèn)題。當(dāng)細(xì)胞所處的環(huán)境發(fā)生改變時(shí)會(huì)發(fā)生什么樣的反應(yīng)？1）適應(yīng)：通過(guò)內(nèi)部的調(diào)整，達(dá)到一個(gè)新的平衡

30、點(diǎn)，繼續(xù)存活。2）不適應(yīng)：通過(guò)內(nèi)部的調(diào)整，無(wú)法平衡，死亡。問(wèn)題來(lái)了，怎么死的？因?yàn)楝F(xiàn)在人們可以觀察到至少3種死亡方式：壞死、凋亡、自噬樣死亡。死了就死了，分那么多方式干嗎？我想，有必要分清楚這3種死亡方式的不同和好處：壞死一般認(rèn)為是刺激過(guò)于 劇烈，細(xì)胞沒(méi)時(shí)間也沒(méi)法修復(fù)，被動(dòng)死亡，內(nèi)容物釋放。凋亡是眾所周知的主動(dòng)的、不可逆的死亡，個(gè)人認(rèn)為，（1）引起凋亡的刺激與引起壞死的刺激在強(qiáng)度上應(yīng)該弱一點(diǎn)。（2）“主動(dòng)”的意思就是死了比活著好。對(duì)誰(shuí)好（有利）呢？凋亡細(xì)胞自己已經(jīng)死了，那么只可能是周?chē)募?xì)胞了。確實(shí)如此，凋亡時(shí)細(xì)胞被“切碎”，里面的成分紛紛變成了熟的“易消化”的食物，以方便周?chē)?xì)胞易攝取。因此，凋亡應(yīng)該是一個(gè)群體水平的概念，是群體應(yīng)對(duì)不利因素時(shí)依靠犧牲部分個(gè)體來(lái)維持群體繼續(xù)存