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文檔簡介
1、菌種選育的目的菌種選育的目的菌種選育的目的菌種選育的目的1.1.提供分子遺傳學(xué)研究材料;提供分子遺傳學(xué)研究材料;2.2.分析生物合成機制;分析生物合成機制;3.3.增加菌種遺傳標(biāo)記;增加菌種遺傳標(biāo)記;4.4.了解菌種遺傳背景。了解菌種遺傳背景。一、科研:一、科研:1.1.產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì);產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì);2.2.改變產(chǎn)品組分;改變產(chǎn)品組分;3.3.抵抗不良培養(yǎng)條件;抵抗不良培養(yǎng)條件;4.4.簡化生產(chǎn)工藝;簡化生產(chǎn)工藝; 5.5.適應(yīng)原材料;適應(yīng)原材料;6.6.縮短生產(chǎn)周期;縮短生產(chǎn)周期;7.7.合成新的化合物;合成新的化合物;8.8.改進質(zhì)量;改進質(zhì)量;9.9.提高產(chǎn)量。提高產(chǎn)量。二
2、、生產(chǎn):二、生產(chǎn):自然篩選自然篩選自然篩選生產(chǎn)菌種自然篩選生產(chǎn)菌種3.3.從一些發(fā)酵制品中分離。從一些發(fā)酵制品中分離。一、從自然界分離所需要的菌株一、從自然界分離所需要的菌株1.1.向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)菌株,從中篩選所向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)菌株,從中篩選所需菌株。如:中國微生物菌種保藏管理委員會需菌株。如:中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCMCCCCM););美國典型菌種保藏中心美國典型菌種保藏中心( (ATCC)ATCC);英國國家典型菌種保藏中心英國國家典型菌種保藏中心( (NCTC)NCTC)等。等。2.2.由自然界采集樣品。由自然界采集樣品。自然篩選自然篩選自然篩選生產(chǎn)菌種自然篩
3、選生產(chǎn)菌種二、把分離到的野生型菌株進一步純化并進二、把分離到的野生型菌株進一步純化并進行代謝產(chǎn)物鑒別。行代謝產(chǎn)物鑒別。樣品的采集樣品的采集具體步驟:具體步驟:(一)、從土壤中采樣(一)、從土壤中采樣細菌(細菌(10108 8) 放線菌(放線菌(10107 7) 霉菌(霉菌(10106 6) 酵酵母菌(母菌(10105 5) 藻類(藻類(10104 4) 原生動物(原生動物(10103 3)根據(jù)土壤有機質(zhì)含量,通氣狀況,酸堿度,根據(jù)土壤有機質(zhì)含量,通氣狀況,酸堿度,植被狀況,地理條件(南植被狀況,地理條件(南 方較好),季節(jié)條方較好),季節(jié)條件(秋季最佳)件(秋季最佳)一、含微生物樣品的采集一、
4、含微生物樣品的采集具體步驟:具體步驟:(二)、根據(jù)微生物生理特點采樣(二)、根據(jù)微生物生理特點采樣微生物營養(yǎng)需求、代謝類型、生理特性。微生物營養(yǎng)需求、代謝類型、生理特性。(三)特殊環(huán)境下采樣(三)特殊環(huán)境下采樣局部環(huán)境條件局部環(huán)境條件極端環(huán)境條件極端環(huán)境條件富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是在是在目的微生物含量較少時目的微生物含量較少時,根據(jù)微生物的生理特,根據(jù)微生物的生理特點,設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基,創(chuàng)造有利的生長條件,點,設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基,創(chuàng)造有利的生長條件,使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖,數(shù)使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖,數(shù)量增加,由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境量增加,由原來
5、自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境中地優(yōu)勢種,以利分離到所需要地菌株。中地優(yōu)勢種,以利分離到所需要地菌株。主要根據(jù)微生物的碳、氮源、主要根據(jù)微生物的碳、氮源、pHpH值、溫度、需氧等值、溫度、需氧等生理因素加以控制。生理因素加以控制。二、富集培養(yǎng)二、富集培養(yǎng)注意:如果按通常分離方法在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)注意:如果按通常分離方法在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠多數(shù)量的目的微生物,則不必進行富集培養(yǎng)。足夠多數(shù)量的目的微生物,則不必進行富集培養(yǎng)。(二)、控制培養(yǎng)條件(二)、控制培養(yǎng)條件 如:細菌、放線菌生長繁殖如:細菌、放線菌生長繁殖pH 7.0-7.5 霉菌、酵母菌生長繁殖霉菌、酵母菌生長繁殖pH 4.5-6(
6、一)、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分(一)、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分( (三三) )、抑制不需要的菌類、抑制不需要的菌類 通過高溫、高壓、加入抗生素等方法通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微減少非目的微生物的數(shù)量,使目的微生物的比例增加。生物的數(shù)量,使目的微生物的比例增加。如:分離芽孢桿菌:土樣加熱至如:分離芽孢桿菌:土樣加熱至80或在或在50%乙醇溶乙醇溶液中浸泡液中浸泡1小時,殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再行分離。小時,殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再行分離。+ +適量膽鹽適量膽鹽+ +十二烷基磺酸鈉抑制十二烷基磺酸鈉抑制G G+ + +少量硫乙醇酸鈉分離厭氧菌少量硫乙醇酸鈉分離厭氧菌三、分離三、分離稀釋平板法稀
7、釋平板法(一)、稀釋平板法(一)、稀釋平板法(pour plate method)將含微生物的樣品用無菌生理鹽水進行梯度將含微生物的樣品用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,取少量與冷卻至稀釋,取少量與冷卻至50的固體培養(yǎng)基混的固體培養(yǎng)基混合,搖勻,倒混菌平板或涂平板,倒置培養(yǎng)合,搖勻,倒混菌平板或涂平板,倒置培養(yǎng)24小時,出現(xiàn)菌落。小時,出現(xiàn)菌落。適用于:數(shù)量占優(yōu)的微生物。好氧,在平板適用于:數(shù)量占優(yōu)的微生物。好氧,在平板上形成菌落的微生物。上形成菌落的微生物。不適用于:相反。不適用于:相反。25g或或25mL225mL無菌生無菌生理鹽水理鹽水1mL9mL10-110-210-310-610-7倒平板
8、平皿劃線分離法平皿劃線分離法(二)、平皿劃線分離法:(二)、平皿劃線分離法:連續(xù)劃線連續(xù)劃線交叉劃線交叉劃線方格劃線方格劃線扇形劃線扇形劃線適用于:好氧,能在平適用于:好氧,能在平皿上形成好的菌落。皿上形成好的菌落。生化反應(yīng)分離生化反應(yīng)分離在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物,使在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物,使培養(yǎng)基渾濁培養(yǎng)基渾濁。能分解底物的微生物便會在菌。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈,圈的大小初步反應(yīng)該菌落周圍產(chǎn)生透明圈,圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。株利用底物的能力。分解水解酶產(chǎn)生菌時多采用,如脂肪酶、淀分解水解酶產(chǎn)生菌時多采用,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶
9、產(chǎn)生菌。粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌。(三)、利用平皿的生化反應(yīng)進行分離(三)、利用平皿的生化反應(yīng)進行分離1.1.透明圈法:透明圈法:透明圈法(1 1)分離淀粉酶產(chǎn)生菌:)分離淀粉酶產(chǎn)生菌:以淀粉為唯一碳源以淀粉為唯一碳源,樣品涂布培養(yǎng)形成單菌,樣品涂布培養(yǎng)形成單菌落后,再用落后,再用碘液碘液浸涂,根據(jù)菌落周圍是否出浸涂,根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株?,F(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。(2 2)分離核酸水解酶產(chǎn)生菌:)分離核酸水解酶產(chǎn)生菌:普通平板,樣品涂布培養(yǎng)長出菌落后覆蓋普通平板,樣品涂布培養(yǎng)長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂,內(nèi)含一層營養(yǎng)瓊脂,內(nèi)含3%3%酵母酵母RNARNA,0.7
10、%0.7%瓊瓊脂及脂及0.10.1mol/L EDTA, pH 7.0,mol/L EDTA, pH 7.0,于于4242左右左右培養(yǎng)培養(yǎng)2-42-4小時,挑四周產(chǎn)生透明圈的菌落。小時,挑四周產(chǎn)生透明圈的菌落。(3 3)分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株:選擇)分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株:選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基+ +CaCOCaCO3 3變色圈法變色圈法(1 1)篩選果膠酶產(chǎn)生菌)篩選果膠酶產(chǎn)生菌0.2%0.2%果膠為唯一碳源培養(yǎng)基平板涂布培養(yǎng)果膠為唯一碳源培養(yǎng)基平板涂布培養(yǎng)長出菌落后,加入長出菌落后,加入0.2%0.2%剛果紅溶液染色剛果紅溶液染色4 4小小時,具有分解果膠能力的菌落周圍會出現(xiàn)時,具有分解果膠
11、能力的菌落周圍會出現(xiàn)絳紅色水解圈。絳紅色水解圈。2.2.變色圈法變色圈法在底物平板中在底物平板中+ +指示劑或顯色劑指示劑或顯色劑生長圈法生長圈法(2 2)分離谷氨酸產(chǎn)生菌)分離谷氨酸產(chǎn)生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基+ +溴百里酚藍(變色范圍在溴百里酚藍(變色范圍在pH 6.2-7.6pH 6.2-7.6,pHpH6.26.2,黃色;黃色;pHpH7.67.6,藍色。)藍色。)3.3.生長圈法生長圈法常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。(缺少某種營養(yǎng)物的)培養(yǎng)基(缺少某種營養(yǎng)物的)培養(yǎng)基+ +營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)缺陷型菌株+ +被被檢菌檢菌抑菌圈法抑菌圈
12、法常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選。常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選。培養(yǎng)基培養(yǎng)基+ +抗生素的敏感菌(作為檢驗菌)抗生素的敏感菌(作為檢驗菌)+ +被檢菌被檢菌采用冷敏感菌篩選抗生素突變株,采用冷敏感菌篩選抗生素突變株,Giuseppe Satta Giuseppe Satta 等從人的病源菌中誘變分離低溫敏感菌突變株(冷等從人的病源菌中誘變分離低溫敏感菌突變株(冷敏菌),在敏菌),在2020以下不生長。將冷敏菌以下不生長。將冷敏菌+ +放線菌孢放線菌孢子混合于平板上子混合于平板上2020培養(yǎng)培養(yǎng)3-43-4天,放線菌生長產(chǎn)抗天,放線菌生長產(chǎn)抗生素,再移至生素,再移至3737培養(yǎng)培養(yǎng)18-2018-
13、20小時,冷敏菌迅速生小時,冷敏菌迅速生長,觀察抑菌圈。長,觀察抑菌圈。4.4.抑菌圈法抑菌圈法變色圈變色圈生長圈生長圈抑菌圈抑菌圈透明圈透明圈組織分離法組織分離法由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法。方法。含菌組織一小塊洗去表面污物后用含菌組織一小塊洗去表面污物后用10%10%漂白漂白粉或粉或0.1%0.1%升汞浸泡升汞浸泡2-52-5分鐘,進行表面消毒,分鐘,進行表面消毒,無菌水沖洗。移至平皿培養(yǎng)基上,適溫?zé)o菌水沖洗。移至平皿培養(yǎng)基上,適溫(25-2625-26)培養(yǎng),再分離純化。)培養(yǎng),再分離純化。(四)、組織分離法(四)、組織分離法單細胞或單孢子
14、分離法單細胞或單孢子分離法濾紙片法:濾紙片法:取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙3-43-4層,浸在培層,浸在培養(yǎng)液中,取出放在空皿內(nèi),在濾紙上滴幾滴養(yǎng)液中,取出放在空皿內(nèi),在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥,蓋好皿蓋,滅菌。將稀釋為甘油以防干燥,蓋好皿蓋,滅菌。將稀釋為15001500mlml-1-1的孢子懸液用滴管滴在濾紙上,每的孢子懸液用滴管滴在濾紙上,每皿約點皿約點2020滴左右,經(jīng)恒溫培養(yǎng),每滴約出現(xiàn)滴左右,經(jīng)恒溫培養(yǎng),每滴約出現(xiàn)1010個菌落,將單菌落移接于斜面上。個菌落,將單菌落移接于斜面上。(五)、單細胞或單孢子分離法(五)、單細胞或單孢子分離法通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行
15、分離通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離1.1.控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分如特殊菌類如特殊菌類-環(huán)保降解菌(降解烴類、有機染料、環(huán)保降解菌(降解烴類、有機染料、表面活性劑、農(nóng)藥等)的分離:以該物質(zhì)為唯一表面活性劑、農(nóng)藥等)的分離:以該物質(zhì)為唯一碳源或氮源進行長時間(幾個月的連續(xù)培養(yǎng))富碳源或氮源進行長時間(幾個月的連續(xù)培養(yǎng))富集培養(yǎng)。集培養(yǎng)。2.2.控制培養(yǎng)基的控制培養(yǎng)基的pHpH3.3.排除不需要的菌類排除不需要的菌類4.4.控制培養(yǎng)溫度控制培養(yǎng)溫度(六)、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離(六)、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離厭氧微生物的分離1.1.加還原劑于培養(yǎng)基中如半胱氨酸等。加還
16、原劑于培養(yǎng)基中如半胱氨酸等。2.2.去氧去氧 :焦性沒食子酸:焦性沒食子酸 + + NaOHNaOH(七)、厭氧微生物的分離(七)、厭氧微生物的分離厭氧微生物分離裝置四、篩選和目的產(chǎn)物的鑒別四、篩選和目的產(chǎn)物的鑒別2.2.搖瓶發(fā)酵篩選搖瓶發(fā)酵篩選搖瓶振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液搖瓶振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液 待測平板打孔待測平板打孔( (厚厚3 3mm mm 內(nèi)徑內(nèi)徑5 5mmmm鋼圈打孔鋼圈打孔)+)+過濾后的發(fā)酵液過濾后的發(fā)酵液1010ulul或滅菌圓濾紙片上滴入或滅菌圓濾紙片上滴入1-21-2ulul發(fā)酵液代發(fā)酵液代替打孔孔或濾紙片的周圍出現(xiàn)活性圈替打孔孔或濾紙片的周圍出現(xiàn)活性圈(溶菌圈或水解圈),根據(jù)其大小
17、判定活力(溶菌圈或水解圈),根據(jù)其大小判定活力大小大小1.1.平板篩選平板篩選這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,通過三角瓶的容量進行小型發(fā)養(yǎng)條件,通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗,以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。酵試驗,以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。五五.毒性試驗毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的,將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心,毒的,將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心,尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種,更應(yīng)慎重。尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種,更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定,微生物中除啤酒酵母、據(jù)有的國家規(guī)定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵
18、母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外,其他微生物作為食用無須作毒性試驗外,其他微生物作為食用,均需通過兩年以上的毒性試驗。為食用,均需通過兩年以上的毒性試驗。誘變育種誘變育種誘誘 變變 育育 種種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高,一個基因的自然突種的機率并不很高,一個基因的自然突變頻率僅變頻率僅1010-6-6-10-10-10-10左右。左右。誘變育種:以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種,誘變育種:以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種,是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。
19、的主要手段。. .提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量;提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量;. .改善菌種特性,提高產(chǎn)品質(zhì)量;改善菌種特性,提高產(chǎn)品質(zhì)量;. .簡化工藝條件;簡化工藝條件;. .開發(fā)新品種開發(fā)新品種一一. .育種目的育種目的. .了解出發(fā)菌株:適宜的培養(yǎng)條件、溫度、了解出發(fā)菌株:適宜的培養(yǎng)條件、溫度、濕度、培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基上的菌落情況。濕度、培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基上的菌落情況。2.2.建立一個準(zhǔn)確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方建立一個準(zhǔn)確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法。法。3.3.研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。二二. .準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1.1.自然選育的
20、具有一定生產(chǎn)能力的野生或至少能少自然選育的具有一定生產(chǎn)能力的野生或至少能少量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的菌株。量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的菌株。2.2.具有有利性狀的菌株,如生長速度快,營養(yǎng)要求具有有利性狀的菌株,如生長速度快,營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株。低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株。3.3.選擇已發(fā)生其它變異的菌株。選擇已發(fā)生其它變異的菌株。4.4.采用采用“增變菌株增變菌株”(對誘變劑的敏感性比原始菌(對誘變劑的敏感性比原始菌株大為提高)的變異菌株。株大為提高)的變異菌株。三、步驟與方法三、步驟與方法(一)出發(fā)菌株的選擇(一)出發(fā)菌株的選擇單細胞或單孢子懸液的制備單細胞或單孢子懸液的制備* *誘變育種工作中,一般
21、采用誘變育種工作中,一般采用3-43-4個出發(fā)菌株,在個出發(fā)菌株,在逐代處理后,將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)逐代處理后,將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。誘變的出發(fā)菌株。(二)單細胞或單孢子懸液的制備(二)單細胞或單孢子懸液的制備采用對數(shù)期細胞或成熟而新鮮的孢子:用發(fā)芽孢采用對數(shù)期細胞或成熟而新鮮的孢子:用發(fā)芽孢子(芽長為孢子子(芽長為孢子 0.5-1 0.5-1倍)或直接用斜面孢子。倍)或直接用斜面孢子。不產(chǎn)生孢子的真菌采用年幼的菌絲體。不產(chǎn)生孢子的真菌采用年幼的菌絲體。均勻的懸液。均勻的懸液。誘變劑及誘變劑量的選擇誘變劑及誘變劑量的選擇(三)誘變劑及誘變劑量的選擇(三)誘變劑
22、及誘變劑量的選擇(1 1)物理誘變劑)物理誘變劑q非電離輻射(只使物質(zhì)分子或原子中的電子非電離輻射(只使物質(zhì)分子或原子中的電子級能提高)級能提高)-紫外線紫外線1.1.誘變劑的種類誘變劑的種類紫外線紫外線誘變機制誘變機制紫外線紫外線誘變機制誘變機制形成胸腺嘧啶二聚體;形成胸腺嘧啶二聚體;嘧啶間的水合作用;嘧啶間的水合作用;DNADNA與蛋白質(zhì)交聯(lián),與蛋白質(zhì)交聯(lián),DNADNA分子間交聯(lián);分子間交聯(lián);DNADNA鏈斷裂。鏈斷裂。紫外線最有效的波長是紫外線最有效的波長是25372537埃。采用埃。采用1515w w紫外線燈紫外線燈管,管,3030cmcm距離。距離。電離輻射電離輻射射線種類射線種類放
23、射源放射源性質(zhì)性質(zhì)能量范圍能量范圍危險性危險性透過組織透過組織的深度的深度X X射線射線X X 光機光機電離輻射電離輻射50-50-300300kvkv危險,有危險,有穿透力穿透力幾幾mm-mm-幾幾cmcm 射線射線放射形同位放射形同位素及核反應(yīng)素及核反應(yīng)同上同上達幾百萬達幾百萬evev同上同上 1 1cmcm中子中子核反應(yīng)堆核反應(yīng)堆或加速器或加速器不帶電子不帶電子的粒子的粒子1 1ev-ev-幾幾百萬百萬evev危險性高,危險性高,穿透力強穿透力強 1 1cmcm 粒子粒子放射性同位放射性同位素或加速器素或加速器電子電子幾百萬幾百萬evev有時有有時有危險危險 1 1cmcm 粒子粒子放射
24、性同放射性同位素位素氦核氦核2 2 10106 6-9 -9 106106evev內(nèi)照射,內(nèi)照射,很危險很危險 1 1cmcmq電離輻射:殺菌率電離輻射:殺菌率90%-99.9%q其它物理誘變劑:微波、紅外線、激光、高能電子流等。其它物理誘變劑:微波、紅外線、激光、高能電子流等。化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑(2).(2).化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑缺失缺失誘變劑誘變劑名稱名稱誘變效應(yīng)誘變效應(yīng)羥胺羥胺亞硝基胍亞硝基胍(NTGNTG)吖啶類吖啶類亞硝酸亞硝酸5-5-BUBUG G C AC A T T A A T GT G C C 顛換顛換移換移換回復(fù)效應(yīng)回復(fù)效應(yīng)+ + + + + + + + + +/ +/
25、+ + + +化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑v大多數(shù)情況下,就突變數(shù)量而言,要比電離輻射更有效。大多數(shù)情況下,就突變數(shù)量而言,要比電離輻射更有效。v化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的,因為只需要少量的合適的誘變化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的,因為只需要少量的合適的誘變劑,設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿,一個蒸氣罩。而用電劑,設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿,一個蒸氣罩。而用電離輻射進行工作時,設(shè)備費用大,并要注意安全性。離輻射進行工作時,設(shè)備費用大,并要注意安全性。v大部分誘變劑是致癌劑,所以在使用中必須非常謹慎,大部分誘變劑是致癌劑,所以在使用中必須非常謹慎,要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸,且切勿吸入其蒸氣,有要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸,
26、且切勿吸入其蒸氣,有人對某些誘變劑極其敏感,甚至未直接接觸就會過敏,這人對某些誘變劑極其敏感,甚至未直接接觸就會過敏,這就更要當(dāng)心。就更要當(dāng)心。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點:使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點:誘變劑的選擇誘變劑的選擇堿基類似物和羥胺堿基類似物和羥胺具有很高的特異性,但很少使用,回具有很高的特異性,但很少使用,回復(fù)突變率高,效果不大。復(fù)突變率高,效果不大。亞硝酸和烷化劑亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣,造成的遺傳損傷較多。應(yīng)用的范圍較廣,造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑超誘變劑”,甲,甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一?;撬嵋阴ナ嵌?/p>
27、性最小的誘變劑之一。吖啶類誘變劑吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷??梢栽斐缮x途徑的完全中斷。紫外線紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑,它能造成不可回復(fù)的缺失突變。但它可能影最好誘變劑,它能造成不可回復(fù)的缺失突變。但它可能影響鄰近基因的性能。響鄰近基因的性能。2.2.誘變劑的選擇誘變劑的選擇誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇(1 1)處理劑量大,殺菌率高()處理劑量大,殺菌率高(90%-99%90%-99%),),在單位存活細胞中負變菌株多,正變菌株少。在單位存活細胞中負變菌株多,正變菌株少。(2 2)用小劑量進行誘變處
28、理時,殺菌率約)用小劑量進行誘變處理時,殺菌率約50%-80%50%-80%,在單位存活細胞中正變株多,然,在單位存活細胞中正變株多,然而大幅度提高產(chǎn)量的菌株可能較少。而大幅度提高產(chǎn)量的菌株可能較少。3.3.誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇(3 3)化學(xué)誘變劑主要是調(diào)節(jié)濃度、處理時)化學(xué)誘變劑主要是調(diào)節(jié)濃度、處理時間、處理條件(溫度、間、處理條件(溫度、pHpH值等)。值等)。物理誘變劑主要是控制照射距離、時間和物理誘變劑主要是控制照射距離、時間和照射過程中的條件(照射過程中的條件(O O2 2、水等)。水等)。誘變劑處理方式誘變劑處理方式(1 1)單因子處理)單因子處
29、理 處理處理1 1次次 連續(xù)重復(fù)使用連續(xù)重復(fù)使用(2 2)復(fù)合因子處理)復(fù)合因子處理 兩個以上因子同時處理兩個以上因子同時處理 不同誘變劑交替處理不同誘變劑交替處理4.4.誘變劑處理方式誘變劑處理方式中間培養(yǎng)(四)中間培養(yǎng)(四)中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前,由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前,有一個有一個表現(xiàn)延遲表現(xiàn)延遲的過程,即細胞內(nèi)原有的過程,即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程酶量的稀釋過程( (生理延遲生理延遲) ),需,需3 3代以上代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要
30、的。極為重要的。中間培養(yǎng)方法 方法:方法: 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時時,以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制,讓細胞繁殖幾,以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制,讓細胞繁殖幾代,以得到純的變異細胞。這樣,隱性的變異代,以得到純的變異細胞。這樣,隱性的變異就會顯現(xiàn)出來,若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng),就會顯現(xiàn)出來,若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng),直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能,形成混雜菌落,同時存在于一個菌落內(nèi)的可能,形成混雜菌落,以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來
31、的菌株退化。突變株的分離與篩選突變株的分離與篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的,以量為主。求的分離菌落為目的,以量為主。復(fù)篩則是精選,以質(zhì)為主,也就是以精確度為主。因此復(fù)篩則是精選,以質(zhì)為主,也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異在具體方法上就有差異. . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者,而將復(fù)篩者,而將90%90%的菌落淘汰。在數(shù)量減
32、少后就要仔細比的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株,最后才能選得優(yōu)秀菌株。較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株,最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段,還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離,純化菌株。在以后的復(fù)篩階段,還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離,純化菌株。(五)突變株的分離與篩選(五)突變株的分離與篩選篩選程序篩選程序1.1.篩選程序篩選程序常規(guī)法常規(guī)法(1 1)常規(guī)法)常規(guī)法誘變誘變第一代:出發(fā)菌株第一代:出發(fā)菌株分離到平皿上(結(jié)合指分離到平皿上(結(jié)合指示劑、呈色劑或底物等)示劑、呈色劑或底物等)挑選菌落挑選菌落(200200個)個)初篩初篩1 1瓶瓶/ /株株5050株株復(fù)篩復(fù)篩3-53-5株(提供第
33、二代株(提供第二代誘變出發(fā)菌株)誘變出發(fā)菌株)第二代:出發(fā)菌株第二代:出發(fā)菌株4 4株株誘變誘變分離到平皿上(結(jié)合指示分離到平皿上(結(jié)合指示劑、呈色劑或底物等)劑、呈色劑或底物等)挑菌落挑菌落100100個菌落個菌落100100個菌落個菌落100100個菌落個菌落100100個菌落個菌落初篩初篩1 1瓶瓶/ /株株5050株株復(fù)篩復(fù)篩3-53-5株(提供株(提供第三代誘變出第三代誘變出發(fā)菌株)發(fā)菌株)第三代、第四代第三代、第四代直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。簡便法簡便法2.2.簡便法簡便法第一代:出發(fā)菌株第一代:出發(fā)菌株誘變誘變分離到平皿上分離到平皿上打瓊脂塊菌落
34、打瓊脂塊菌落1000-30001000-3000塊塊檢定板上挑取檢定板上挑取5%-10%5%-10%透明圈、透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落呈色圈、抑菌圈大的菌落初篩初篩1-21-2瓶瓶/ /株株30-5030-50株株復(fù)篩復(fù)篩3-53-5瓶瓶/ /株株3-53-5株(提供第二代誘株(提供第二代誘變出發(fā)菌株)變出發(fā)菌株)第二代:出發(fā)菌株第二代:出發(fā)菌株4 4株株誘變誘變分離到平皿上分離到平皿上打瓊脂塊打瓊脂塊1000-30001000-3000塊塊檢定板上挑取檢定板上挑取5%-10%5%-10%透明圈、透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落呈色圈、抑菌圈大的菌落初篩初篩1-21-2瓶瓶/ /株株30-5
35、030-50株株復(fù)篩復(fù)篩3-53-5瓶瓶/ /株株3-53-5株(提供第三代株(提供第三代誘變出發(fā)菌株)誘變出發(fā)菌株)第三代、第四代第三代、第四代直到選育到符合要求的直到選育到符合要求的優(yōu)良菌株。優(yōu)良菌株。特點特點(1 1)分離采用瓊脂塊法;)分離采用瓊脂塊法; (2 2)初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析采用)初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析采用簡便、快速的瓊脂平板測定法或其他簡便方簡便、快速的瓊脂平板測定法或其他簡便方法。法。隨機篩選隨機篩選2.2.篩選方法篩選方法出發(fā)菌株出發(fā)菌株誘變誘變平皿生長平皿生長出菌落出菌落隨機挑選菌隨機挑選菌落于斜面落于斜面接種三角瓶接種三角瓶振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)測定產(chǎn)物活性的測定產(chǎn)
36、物活性的高低,決定取舍高低,決定取舍缺點:如果菌落挑取少了,很難篩選到理想的突變株缺點:如果菌落挑取少了,很難篩選到理想的突變株(因為突變概率?。ㄒ驗橥蛔兏怕市。? 1)隨機篩選(搖瓶篩選)隨機篩選(搖瓶篩選)初篩方法初篩方法平板菌落篩選平板菌落篩選 可根據(jù)菌落形態(tài)或利用菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與可根據(jù)菌落形態(tài)或利用菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中檢定菌、底物或指示劑作用后,在其培養(yǎng)基中檢定菌、底物或指示劑作用后,在其周圍形成抑菌圈、呈色圈或其他特異性反應(yīng)圈,周圍形成抑菌圈、呈色圈或其他特異性反應(yīng)圈,測定反應(yīng)圈直徑。測定反應(yīng)圈直徑。如:紅霉素如:紅霉素誘變誘變突變株帶色素(低產(chǎn)株)突變株帶色素(低產(chǎn)
37、株) 產(chǎn)孢子菌產(chǎn)孢子菌誘變誘變不產(chǎn)孢子突變株不產(chǎn)孢子突變株 由突變引起形態(tài)劇烈變化的菌落(負突變多)由突變引起形態(tài)劇烈變化的菌落(負突變多) (2 2)平板菌落篩選(搖瓶初篩前的一種預(yù)篩)平板菌落篩選(搖瓶初篩前的一種預(yù)篩)根據(jù)菌落形態(tài)根據(jù)菌落形態(tài)突變的高產(chǎn)菌株其菌落形態(tài)往往在常態(tài)的正常范圍突變的高產(chǎn)菌株其菌落形態(tài)往往在常態(tài)的正常范圍內(nèi),因為它們的遺傳物質(zhì)僅受到微小損傷,還保留內(nèi),因為它們的遺傳物質(zhì)僅受到微小損傷,還保留了正常代謝的基本功能。了正常代謝的基本功能。一個菌株的高產(chǎn)性能是經(jīng)過多代微小突變累積的,一個菌株的高產(chǎn)性能是經(jīng)過多代微小突變累積的,一代誘變后的菌落形態(tài)與直接親本之間形態(tài)變化一
38、一代誘變后的菌落形態(tài)與直接親本之間形態(tài)變化一般不明顯,但經(jīng)長期多代誘變后,高產(chǎn)菌株與其最般不明顯,但經(jīng)長期多代誘變后,高產(chǎn)菌株與其最原始的親代在形態(tài)特征上還是有明顯差異。原始的親代在形態(tài)特征上還是有明顯差異。根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選濃度梯度法濃度梯度法加入抗生素加入抗生素上層不加抗生素,上層不加抗生素,接種涂平板接種涂平板低低濃濃度度高高濃濃度度(3).(3).濃度梯度法濃度梯度法瓊脂塊法瓊脂塊法 日本人八木建立,此法廣泛用于抗生素和酶類日本人八木建立,此法廣泛用于抗生素和酶類等突變株的篩選。等突變株的篩選。 優(yōu)點優(yōu)點:準(zhǔn)確性比直接平板上特異性反應(yīng)圈更可:準(zhǔn)確性比直接平
39、板上特異性反應(yīng)圈更可靠;方法較為簡便;篩選量很大,一次可篩選靠;方法較為簡便;篩選量很大,一次可篩選瓊脂塊上的菌落達瓊脂塊上的菌落達1000-30001000-3000個或更高。(比個或更高。(比常規(guī)篩選量提高常規(guī)篩選量提高15-2015-20倍)倍)(4 4)瓊脂塊法)瓊脂塊法單孢子懸液單孢子懸液誘變誘變接種到瓊脂平皿上接種到瓊脂平皿上(20-50個菌落個菌落/皿)皿)用直徑用直徑6mm打孔器打孔器每皿每皿80-120瓊脂塊瓊脂塊直徑直徑9 cm平皿中平皿中加入加入20ml培養(yǎng)基培養(yǎng)基保持一定濕度保持一定濕度29,4-5天天生物鑒定平板生物鑒定平板每板每板130-150塊塊含供試菌種含供試菌
40、種29,17-18小時小時選出菌落接入斜面選出菌落接入斜面其他其他復(fù)印技術(shù)復(fù)印技術(shù)應(yīng)用:從平板上可直接篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含量的突應(yīng)用:從平板上可直接篩選產(chǎn)脂野生株和具有高脂含量的突變株,是產(chǎn)脂微生物的簡便檢測方法。變株,是產(chǎn)脂微生物的簡便檢測方法。步驟:步驟:誘發(fā)產(chǎn)脂的限氮培養(yǎng)基制平板,接種誘發(fā)產(chǎn)脂的限氮培養(yǎng)基制平板,接種3030培養(yǎng)培養(yǎng)3-43-4天。天。在平皿上覆蓋一張濾紙(直徑在平皿上覆蓋一張濾紙(直徑9 9cmcm,1 1號),用號),用“絲絨印模絲絨印?!陛p壓后取出已復(fù)印菌落的濾紙,置于輕壓后取出已復(fù)印菌落的濾紙,置于5050,干燥,干燥2020minmin。(5 5)其它)其
41、它將濾紙浸入含蘇丹黑(質(zhì)量體積比為將濾紙浸入含蘇丹黑(質(zhì)量體積比為0.08%0.08%,溶劑,溶劑95%95%乙醇)溶液的平皿內(nèi),染色乙醇)溶液的平皿內(nèi),染色2020minmin。取出濾紙,放入取出濾紙,放入95%95%乙醇平皿中輕搖乙醇平皿中輕搖3 3minmin去多余染去多余染料。料。取出放入取出放入95%95%乙醇平皿中脫色乙醇平皿中脫色5 5minmin。將濾紙干燥,高脂酵母菌落呈現(xiàn)深藍色或紫色,而將濾紙干燥,高脂酵母菌落呈現(xiàn)深藍色或紫色,而低脂菌落為淺藍色或無色。低脂菌落為淺藍色或無色。搖瓶液體培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)其培養(yǎng)條件接近于發(fā)酵罐,可作為發(fā)酵工藝模擬其培養(yǎng)條件接近于發(fā)酵罐,可作為發(fā)
42、酵工藝模擬試驗,選出的菌種易推廣到大生產(chǎn)中去。試驗,選出的菌種易推廣到大生產(chǎn)中去。初篩:初篩:1 1瓶瓶/ /株,逐個進行活性測定,凡生產(chǎn)能力株,逐個進行活性測定,凡生產(chǎn)能力比出發(fā)菌株高比出發(fā)菌株高10%10%以上的進行保種和復(fù)篩。以上的進行保種和復(fù)篩。復(fù)篩:復(fù)篩:3-53-5瓶瓶/ /株,觀測重復(fù)性。株,觀測重復(fù)性。* *注意:培養(yǎng)條件要盡量與大生產(chǎn)發(fā)酵條件相近。注意:培養(yǎng)條件要盡量與大生產(chǎn)發(fā)酵條件相近。培養(yǎng)條件的相似性:搖瓶型號、裝量、瓶塞厚度、培養(yǎng)條件的相似性:搖瓶型號、裝量、瓶塞厚度、搖瓶轉(zhuǎn)速、溫度、搖瓶位置、室內(nèi)相對濕度等。搖瓶轉(zhuǎn)速、溫度、搖瓶位置、室內(nèi)相對濕度等。復(fù)篩方法復(fù)篩方法搖
43、瓶液體培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)產(chǎn)物活性測定產(chǎn)物活性測定一般突變規(guī)律:一個出發(fā)菌株通過一次誘變,生產(chǎn)一般突變規(guī)律:一個出發(fā)菌株通過一次誘變,生產(chǎn)能力提高能力提高5%5%的突變株約為的突變株約為1/501/50,而生產(chǎn)能力提高,而生產(chǎn)能力提高10%10%以上的突變株約為以上的突變株約為1/3001/300。通常誘變一代至少要挑選通常誘變一代至少要挑選10001000株以上,經(jīng)平皿預(yù)篩株以上,經(jīng)平皿預(yù)篩后,約保留后,約保留200200株進行搖瓶初篩。株進行搖瓶初篩。經(jīng)典法:蛋白酶測定采用分光光度法;脂肪酶測經(jīng)典法:蛋白酶測定采用分光光度法;脂肪酶測定采用定采用NaOHNaOH滴定法;滴定法;。缺點是操作繁瑣
44、、樣品。缺點是操作繁瑣、樣品不能同時測定,帶來誤差。不能同時測定,帶來誤差。(六)產(chǎn)物活性測定(六)產(chǎn)物活性測定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整快速檢驗法:快速檢驗法:瓊脂平板活性圈法:平板打孔加入發(fā)酵液或濾紙片瓊脂平板活性圈法:平板打孔加入發(fā)酵液或濾紙片浸透發(fā)酵液覆蓋于瓊脂平板上(加有檢驗菌或底浸透發(fā)酵液覆蓋于瓊脂平板上(加有檢驗菌或底物)。物)。其他法其他法(七)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整(七)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種實例一實例一 紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用紫外線誘變一般采用1515W W紫外線殺菌燈,紫外線殺菌燈,波長為波長
45、為25372537埃埃燈與處理物的距離為燈與處理物的距離為15153030cmcm,照射時間依菌種而異,一般為照射時間依菌種而異,一般為幾秒幾秒至幾十分鐘至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率。一般我們常以細胞的死亡率表示,希望照射的劑量表示,希望照射的劑量死亡率控制在死亡率控制在707080%80%為宜。為宜。被照射的菌懸液細胞數(shù),被照射的菌懸液細胞數(shù),細菌為細菌為10106 6個個mlml左右,左右,霉菌孢子和酵母細胞為霉菌孢子和酵母細胞為10106 610107 7個個mlml。由于紫外線穿透力不強,要求照射由于紫外線穿透力不強,要求照射液不要太深,液不要太深,約約0.50.51.01.0
46、cmcm厚厚,同時要用,同時要用電磁攪拌器或手工進行電磁攪拌器或手工進行攪拌攪拌,使照射均勻。,使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng),所以照由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng),所以照射時和照射后的處理應(yīng)射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。在紅燈下進行。操作步驟操作步驟單細胞懸液制備單細胞懸液制備 將細菌培養(yǎng)液以將細菌培養(yǎng)液以30003000r rminmin離心離心5 5minmin,傾去上清傾去上清液,將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。液,將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 將菌懸液放入一巳滅菌的,裝有玻璃珠的三角瓶將菌懸液放入一巳滅菌的,裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動,以打散菌體。將菌液
47、倒入有定性濾內(nèi)用手搖動,以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾,單細胞濾液裝入試管內(nèi),一般紙的漏斗內(nèi)過濾,單細胞濾液裝入試管內(nèi),一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達10108 8個個mlml左右,左右,作為待處理菌懸液。作為待處理菌懸液。操作步驟操作步驟紫外線照射紫外線照射 取取2 24 4m1m1制備的菌液加到直徑制備的菌液加到直徑9 9cmcm培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)皿內(nèi),放入一無菌磁力攪拌子,然后置磁力攪拌放入一無菌磁力攪拌子,然后置磁力攪拌器上、器上、1515W W紫外線下紫外線下3030cmcm處。在正式照射前,處。在正式照射前,應(yīng)先開紫外線應(yīng)先開紫外線101
48、0minmin,讓紫外燈預(yù)熱,然后讓紫外燈預(yù)熱,然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射開啟皿蓋正式在攪拌下照射10105050s s。操作操作均應(yīng)在紅燈下進行,或用黑紙包住,避免均應(yīng)在紅燈下進行,或用黑紙包住,避免白熾光。白熾光。 殺菌率計算殺菌率計算 取未照射的制備菌液和照射菌液各取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5mL進行稀進行稀釋分離,計數(shù)活菌細胞數(shù)。釋分離,計數(shù)活菌細胞數(shù)。 中間培養(yǎng)中間培養(yǎng) 取照射菌液取照射菌液2mL于液體培養(yǎng)基中于液體培養(yǎng)基中(300mL三角瓶內(nèi)三角瓶內(nèi)裝裝30mL培養(yǎng)液培養(yǎng)液),120rmin振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)46h。 分離、篩選分離、篩選 取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。挑取菌
49、落進行篩取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。挑取菌落進行篩選。選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌實例二實例二 亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基甲基N-硝基硝基-N-亞硝基胍亞硝基胍(NGN,MNNG或或TG)對真核或原核微生物都有強對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚,據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及清楚,據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸,直接作用于細在酸性條件下生成亞硝酸,直接作用于細胞內(nèi)的胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng),從而誘發(fā)了變異。復(fù)制系統(tǒng),從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨的誘變作用隨pH的升高而增強
50、。的升高而增強。 單孢子懸液制備單孢子懸液制備 取斜面,加入取斜面,加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸緩的磷酸緩沖液,用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管,立即通過沖液,用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管,立即通過帶濾紙漏斗過濾,由此制得單孢子懸液,若孢子帶濾紙漏斗過濾,由此制得單孢子懸液,若孢子液渾濁狀,其孢子濃度可達液渾濁狀,其孢子濃度可達l06個個mL,此為待此為待處理孢子懸液。處理孢子懸液。 MNNG溶液的制備溶液的制備 用分析天平稱取用分析天平稱取2mg,加入加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解。磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解。操作步驟操作步驟操作步驟操作步驟 單孢
51、子懸液制備單孢子懸液制備 取斜面,加入取斜面,加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸緩的磷酸緩沖液,用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管,立即通過沖液,用接種環(huán)刮下孢子,振蕩試管,立即通過帶濾紙漏斗過濾,由此制得單孢子懸液,若孢子帶濾紙漏斗過濾,由此制得單孢子懸液,若孢子液渾濁狀,其孢子濃度可達液渾濁狀,其孢子濃度可達l06個個mL,此為待此為待處理孢子懸液。處理孢子懸液。 MNNG溶液的制備溶液的制備 用分析天平稱取用分析天平稱取2mg,加入加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解。磷酸緩沖液,于暗處振蕩溶解。誘變處理誘變處理 吸取吸取MNNG溶液溶液lmL,加入到加入
52、到1mL孢子懸液中,孢子懸液中,30振蕩振蕩30min,立即稀釋立即稀釋1000倍停止作用,倍停止作用,然后以然后以10-2,10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng),兩個稀釋度分離培養(yǎng),30 3天后計數(shù)。天后計數(shù)。 死亡率計算死亡率計算 將未處理的孢子液將未處理的孢子液1mL加入加入1mL磷酸緩沖液中,磷酸緩沖液中,同上逐級稀釋分離,同上逐級稀釋分離, 30下培養(yǎng)下培養(yǎng)3天。根據(jù)處天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。分離、篩選分離、篩選 挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選實例三、營養(yǎng)缺陷型菌株的
53、篩選實例三、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選2.2.營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型(auxotrophauxotroph):):由于基因突變引起代謝過由于基因突變引起代謝過程中某種酶合成能力喪失的突變型,它們必須在原有培養(yǎng)基程中某種酶合成能力喪失的突變型,它們必須在原有培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長。中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長。1.1.野生型菌株野生型菌株(wild typestrainwild typestrain):):從自然界分離到的從自然界分離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株。微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株。一、定義:定義:基本培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基(minimal medium, MMmini
54、mal medium, MM):僅能滿足微生僅能滿足微生物物野生型菌株野生型菌株生長所需的培養(yǎng)基。用生長所需的培養(yǎng)基。用-表示。不同微生物的表示。不同微生物的基本培養(yǎng)基是不同的。基本培養(yǎng)基是不同的。補充培養(yǎng)基(補充培養(yǎng)基(supplemental medium, SMsupplemental medium, SM):凡只凡只能滿足能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基。生長需要的組合培養(yǎng)基。由由MM+MM+該菌株不能合成的營養(yǎng)因子而組成。該菌株不能合成的營養(yǎng)因子而組成。完全培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基(complete medium, CMcomplete medium, CM):凡
55、可滿足凡可滿足一一切營養(yǎng)缺陷型菌株切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需求的天然或半合成培養(yǎng)基。用符號營養(yǎng)需求的天然或半合成培養(yǎng)基。用符號+表示。一般可在表示。一般可在MMMM中加入富含氨基酸、維生素和堿基之中加入富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)配制成。類的天然物質(zhì)配制成。(一)營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)(一)營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā):亞硝基胍、紫外線、:亞硝基胍、紫外線、亞硝酸等作誘變劑。亞硝酸等作誘變劑。二、步驟:二、步驟:淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株(二)淘汰野生型菌株(二)淘汰野生型菌株細菌:青霉素法(抑制肽聚糖交鏈)細菌:青霉素法(抑制肽聚糖交鏈)真菌:制霉素法(作用于細胞膜上的甾醇,引起真菌:制霉素法(作用于
56、細胞膜上的甾醇,引起細胞膜損傷)細胞膜損傷)將誘變處理后的菌體用將誘變處理后的菌體用CMCM振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2-32-3代后,離心、代后,離心、洗滌菌體,轉(zhuǎn)移至洗滌菌體,轉(zhuǎn)移至MMMM中饑餓培養(yǎng)中饑餓培養(yǎng)4-64-6小時,轉(zhuǎn)至小時,轉(zhuǎn)至MMMM中(中(+20%+20%蔗糖)培養(yǎng)蔗糖)培養(yǎng)3-43-4小時,加一定濃度的青霉小時,加一定濃度的青霉素。素。1.1.抗生素法:抗生素法:+ +MMMM振蕩培養(yǎng)約振蕩培養(yǎng)約1010小時,用滅菌的脫脂棉或濾紙等小時,用滅菌的脫脂棉或濾紙等除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng),每隔除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng),每隔3-43-4小時過濾一次,重小時過濾一次,重復(fù)復(fù)3-43-4次。次。誘變,
57、誘變,MMMM振蕩培養(yǎng),加熱至振蕩培養(yǎng),加熱至8080。2.2.菌絲過濾法(絲狀菌)菌絲過濾法(絲狀菌)3.3.高溫殺菌法(芽孢菌)高溫殺菌法(芽孢菌)(三)營養(yǎng)缺陷型的檢出(三)營養(yǎng)缺陷型的檢出點植對照法點植對照法1.1.點植對照法(點種法點植對照法(點種法)CMMMCM突突變變株株影印法影印法2.2.影印法影印法CM8cmMM高高10cm+0.5%+0.5%脫氧膽酸脫氧膽酸鈉防止菌落擴散鈉防止菌落擴散Yi 夾層法3.夾層法(延遲補給法)MM(?。┍。㎝M(含菌)含菌)MMCM最上層最上層MMMM傾注后培養(yǎng)傾注后培養(yǎng)2424小時,非營養(yǎng)缺陷型菌株小時,非營養(yǎng)缺陷型菌株生長成菌落,再傾注最后一
58、層生長成菌落,再傾注最后一層CM,在在MMMM上不長,上不長,后在后在CMCM上長出的小的菌落為營養(yǎng)缺陷型菌落。上長出的小的菌落為營養(yǎng)缺陷型菌落。限量補充培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法限量某種營養(yǎng)物質(zhì)(如限量某種營養(yǎng)物質(zhì)(如0.01%0.01%蛋白胨),野生蛋白胨),野生型長出大菌落,缺陷型長出小菌落。型長出大菌落,缺陷型長出小菌落。4.4.限量補充培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法營養(yǎng)缺陷型的鑒定營養(yǎng)缺陷型的鑒定(四)營養(yǎng)缺陷型的鑒定(四)營養(yǎng)缺陷型的鑒定1.1.測定缺陷型菌株所需生長因子的類別(哪測定缺陷型菌株所需生長因子的類別(哪類的判定)類的判定)(1 1)氨基酸混合物()氨基酸混合物(2121種);種);(
59、2 2)維生素混合物()維生素混合物(1515種);種);(3 3)核酸堿基混合液或酵母核酸()核酸堿基混合液或酵母核酸(0.1%0.1%););(4 4)酵母浸出液。)酵母浸出液。待鑒定菌從斜面上用生理鹽水刮洗,離心洗滌,待鑒定菌從斜面上用生理鹽水刮洗,離心洗滌,制成制成10106 6-10-108 8個個/ /mlml的菌懸液,取的菌懸液,取0.10.1mlml加入加入MMMM中,中,混勻到平皿,凝固后用濾紙片分別沾各類物質(zhì)混勻到平皿,凝固后用濾紙片分別沾各類物質(zhì)覆于平板上,培養(yǎng)后觀察生長圈。覆于平板上,培養(yǎng)后觀察生長圈。2.2.具體測出缺陷型所需生長因子具體測出缺陷型所需生長因子分組測定
60、分組測定19631963年年Epstein.R.H.Epstein.R.H.最先研究。最先研究。在在許可的溫度許可的溫度下能正常生長,在下能正常生長,在非許可的溫度非許可的溫度條條件下不能生長或微弱生長,表型與野生型不同,件下不能生長或微弱生長,表型與野生型不同,這種條件致死突變株即這種條件致死突變株即TsTs突變株。突變株。溫度敏感突變株溫度敏感突變株溫度敏感突變株(溫度敏感突變株(temperature-temperature-sensitive mutantsensitive mutant)的篩選的篩選TsTs突變株累積中間發(fā)酵產(chǎn)物的機理:突變株累積中間發(fā)酵產(chǎn)物的機理:突變導(dǎo)致某種酶的結(jié)
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