JS-YZ-15需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證方案

1、需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證方案編碼js-yz-15版本00版制定人日期2015年3月14日審核人日期2015年3月15日批準(zhǔn)人日期2015年3月16日實施日期2015年3月17日總頁數(shù)共10頁目錄_、驗證概述二驗證目的三、驗證方案適用范圍四、參考文獻五、驗證組織職責(zé)及培訓(xùn)確認六、驗證內(nèi)容七、異常情況處理程序八、再驗證周期九、驗證結(jié)果評定與結(jié)論 十、附件1驗證概述微生物限度檢查法是用于非規(guī)定滅菌制劑、原輔料及其原輔料受微生物污染程度的方 法。檢查項目包括能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌。當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法 時，應(yīng)進行微生物的計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物

2、計數(shù)。若 檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。2驗證目的(1 )確認采用薄膜過濾法計數(shù)的方法適用于微生物限度檢查微生物計數(shù)測定。(2 )驗證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定內(nèi)容進行，若因特殊原因確需變更時，應(yīng)驗證方案修改申請及批準(zhǔn)書(附錄2)，報驗證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)。3驗證方案適用范e本方案適用于微生物限度檢查微生物計數(shù)方法驗證的全過程。4參考文獻中華人民共和國藥典s. 2015年版5驗證組織職責(zé)根據(jù)驗證管理制度(文件編碼：sjsw/zd-45 )的規(guī)定，成立驗證工作小組，其組員如表1所示：表1 驗證小組成員表驗證組組長姓名職務(wù)部門張成雄經(jīng)理質(zhì)量部成員姓名職務(wù)部門工程師技術(shù)部生產(chǎn)

3、主任生產(chǎn)部設(shè)備部檢驗員質(zhì)量部檢驗員質(zhì)量部5.1驗證小組的職責(zé)如下：5.1.1企業(yè)質(zhì)量負責(zé)人5.1.1.1負責(zé)驗證方案的批準(zhǔn)，驗證合格證的簽發(fā)。5.1.1.2參與驗證立項會議及最終驗證評審會議，提供各種建議和意見。5.1.2驗證小組組長5.1.2.1負責(zé)組織驗證小組，起草驗證方案。5.1.2.2負責(zé)對驗證小組成員進行培訓(xùn)。5.1.2.3負責(zé)組織驗證的實施，處理驗證過程中出現(xiàn)的異常情況，必要時向企 業(yè)質(zhì)量負責(zé)人匯報。5.1.2.4負責(zé)撰寫驗證總結(jié)和報告。5.1.3驗證小組成員5.1.3.1負責(zé)驗證工作的實施，收集驗證數(shù)據(jù)，填寫各項驗證記錄。5.1.3.2負責(zé)確認驗證過程中所使用的各種計量器具在有效

4、期內(nèi)，各種設(shè)備處 于正常的有效的運行狀態(tài)，且得到驗證。5.1.4驗證協(xié)調(diào)員5.1.4.1驗證協(xié)調(diào)員由質(zhì)量管理部門的質(zhì)量管理人員擔(dān)任。5.1.4.2驗證協(xié)調(diào)員負責(zé)所參與的驗證項目的質(zhì)量管理過程的跟蹤、信息搜集 反饋等工作。5.1.4.3驗證協(xié)調(diào)員負責(zé)驗證過程中驗證小組與公司內(nèi)部其他未參與驗證工作 的部門的相關(guān)工作的溝通和協(xié)調(diào)。6驗證內(nèi)容6.1驗證過程所需的設(shè)備、儀器/儀表，其中儀器/儀表須說明其檢定/校準(zhǔn)或驗證信息，確認是否滿足驗證要求。驗證所涉及的設(shè)備、儀器/儀表如表2所示。表2驗證所需設(shè)備、儀器/儀表序號儀器/儀表名稱制造商規(guī)格型號是否在有效期備注1生化培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械有限公司spx-

5、802手提式壓力蒸汽 滅菌器嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司yxq-280sd3生物安全柜6.2實驗中所有試劑6.2.1驗證用培養(yǎng)基：驗證過程中所使用的培養(yǎng)基信息如表3所示表3 驗證用培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)廠商批號胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基自行配制沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基自行配制6.3驗證方法6.3.1菌液的制備6.3.1.1按表4規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞肝、枯草芽抱桿菌、白色念球菌的新鮮培養(yǎng)物，用ph7.0無菌氯化鈉蛋白豚緩沖液或0.9%r=i化鈉溶液制成約100cfu/ml的菌懸液。6.3.1.2取黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物，加入3-5ml含0.05% （ ml/ml ）聚山梨脂80的0.

6、9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用適宜方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05% （ ml/ml ）聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成約100cfu/ml的黑曲霉電子懸液。6.3.2接種和稀釋：驗證用菌株：驗證用菌株（不大于第5代）如表4所示。試驗分為三組，進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌的菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值。表4驗證用菌株驗證菌株培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基銅綠假單胞菌胰酪大豆腺瓊脂培養(yǎng)基枯草芽抱桿菌胰酪大豆籐瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基黑曲霉菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度（°c ）培養(yǎng)時間（小

7、時）30-3548-2430-3518-2430-3518-2420-2548-7220-25120-1686.3.2.1試驗組：取純化水原液1ml ,加入試驗菌液1ml，混勻，使每1ml供試液中含菌量不大于wocfuo6.3.2.2供試品對照組：取純化水原液2ml ,同試驗組操作。6.3.2.3菌液對照組：取試驗菌液2ml ,同試驗組操作。倒置培養(yǎng)。每種計6.3.2.4陰性對照試驗：取無菌平皿，注入培養(yǎng)基，凝數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。6.3.3供試品中微生物回收6.3.3.1平皿法包括傾注法和涂布法。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。傾注法:取照

8、上述“供試液的準(zhǔn)備”“接種和稀釋”制備的供試液1ml ,置直徑90mm的無菌平皿中，注入15-20ml溫度不超過459熔化的胰酪大豆籐瓊脂培養(yǎng)基或沙氏 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng) 增加。需氧菌置30-35°c下培養(yǎng)72小時，計數(shù)。霉菌和酵母菌置20-25°c下培養(yǎng)120小 時，計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)，計算各試驗組的平均菌落數(shù)。涂布法:取15-20ml溫度不超過459熔化的胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表 面干燥。每一平板表

9、面接種上述照“供試液的準(zhǔn)備”“接種和稀釋”制備的供試液不少于1ml ,需氧菌置30-35°c下培養(yǎng)72小時，計數(shù)。霉菌和酵母菌置20-25°c下培養(yǎng)120小時，計 數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)，計算各試驗組的平均菌落數(shù)。6.4.2薄膜過濾法濾膜直徑一般為50mm ,孔徑不大于0.45pm ,濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。取1ml的供試品過濾，若測定需氧 曲總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆月東瓊脂培養(yǎng)基平板上，置30-35°c下培養(yǎng)72小 時，計數(shù)。；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂

10、培養(yǎng)基平板 上，置20-25°c下培養(yǎng)120小時，計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。6.5結(jié)果判斷：在3次獨立的平行試驗中，若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組落數(shù)的比值在0.5-2范圍內(nèi)，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的 需氧菌、霉菌及酵母菌數(shù)。6.6驗證結(jié)果：計數(shù)結(jié)果填報于微生物計數(shù)方法驗證記錄（見附件3 ）7異常情況處理程序驗證過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行操作和判定。岀現(xiàn)個別項目不符 合標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果時，應(yīng)按下列程序進行處理：7.1重新抽取樣品進行檢測。7.2若屬于方案設(shè)定的原因，必要時報驗證小組，填寫異常情況處理表（見附件1 ）,若

11、有需要，可填寫風(fēng)險分析報告并逐級遞交，或提交驗證方案修改申請及批準(zhǔn) 書（見附件2）并逐級遞交。8再驗證周期8.1更換檢驗程序或計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。8.2檢測產(chǎn)品發(fā)生變化應(yīng)重新驗證。8.3每年應(yīng)對檢驗方法進行再驗證9驗證結(jié)果評定與結(jié)論小組成員負責(zé)收集各項驗證結(jié)果記錄，報驗證小組，驗證組長負責(zé)對驗證結(jié)果進行綜合 評審，做出驗證結(jié)論，填寫驗證結(jié)果審批記錄表。滿足驗證目的發(fā)放驗證合格證（見附 件4 ）。附件1異常情況處理表驗證編號事件編號事件描述：發(fā)生部門簽字：日期：年月日事件處理影響等級輕度的嚴(yán)重的致命的災(zāi)難的糾偏措施描述執(zhí)行人/部門：計劃完成時間：調(diào)查部門 簽名/日期部門1部門2部門3部門4部門5糾偏措施復(fù)測/復(fù)查結(jié)果結(jié)論 p/cf檢查人/日期：qa確認/日期：批準(zhǔn)人/日期附件2驗證方案修改申請及批準(zhǔn)書驗證方案 名稱驗證方案編號修改內(nèi)容修改原因 及依據(jù)修改后方案起草人部門負責(zé)人年 月曰驗證 小組審批驗證小組組長：年 月 日附件3需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證的測定結(jié)果（cfu）實驗開始時間年 月 日實驗結(jié)束時間年 月曰菌類試驗用菌種測定項目試驗組菌液組供試品對照組陰性對照