柿采后丙烯和1甲基環(huán)丙烯處理對兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)的影響

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2014，41（6）：10891095 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140210；修回日期：20140410 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30771756）；農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 * 通信作者 author for correspondence（e-mail：dqr0723） 柿采后丙烯和1甲基環(huán)丙烯處理對兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)的影響 孫振營，韓 葉，李秀芳，馬秋詩，饒景萍* （西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 7

2、12100） 摘 要：為進(jìn)一步了解擴(kuò)展蛋白（expansin，exp）在柿果實(shí)采后軟化過程中的作用，以丙烯和1甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-mcp）處理富平尖柿采后果實(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測果實(shí)中exp基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，丙烯促進(jìn)柿果實(shí)成熟軟化，使乙烯釋放高峰升高并提前到來，提高acc合成酶（acs）、acc氧化酶（aco）活性；1-mcp減緩柿果實(shí)的成熟軟化，推遲并降低乙烯釋放高峰，抑制acs和aco活性。隨著貯藏時(shí)間的延長，柿果實(shí)逐漸軟化，對照果實(shí)dkexp3和dkexp4的相對表達(dá)量均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。丙烯處理促進(jìn)了dkexp3和dk

3、exp4的表達(dá)，使表達(dá)高峰升高且提早到來；1-mcp處理抑制了dkexp3和dkexp4的表達(dá)，推遲且降低了表達(dá)高峰。對照和1-mcp處理的果實(shí)的dkexp3和dkexp4的相對表達(dá)量高峰均較乙烯釋放高峰早。dkexp3和dkexp4在果皮、果肉、果心中表達(dá)水平不同。本結(jié)果說明exp可能在采后柿果實(shí)成熟軟化前期起作用，其表達(dá)有組織特異性，且受到乙烯的調(diào)控。 關(guān)鍵詞：柿；丙烯；1甲基環(huán)丙烯；exp；實(shí)時(shí)熒光定量pcr 中圖分類號：s 665.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）06-1089-07 effects of propylene and 1-methylcycl

4、opropene on expression of two exp genes in persimmon fruits sun zhen-ying，han ye，li xiu-fang，ma qiu-shi，and rao jing-ping* （college of horticulture，northwest a & f university，yangling，shaanxi 712100，china） abstract：in order to further explore the function of expansins（exp）in the postharvest soft

5、ening progress of persimmon fruits，fuping jianshiwas treated with 1-mcp and propylene，respectively. real- time fluorescent quantitative pcr technology was used to detect the relative expression level of exp genes in persimmon fruits. the results showed that propylene treatment promoted the softening

6、 of persimmon fruits，increased ethylene production and advanced the onset of climactic of ethylene production and accelerated the enzymatic activity of acs and aco. however，1-mcp treatment delayed the softening of persimmon fruits，retarded and reduced the peak of ethylene production，inhibited the en

7、zymatic activity of acs and aco. accompanying with fruit ripening，the expression levels of dkexp3 and dkexp4 in control fruit increased sharply to maximum within the first 9 d of storage，followed by a 1090 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 steady decline until the end of storage. treatment with propylene promoted the exp

8、ression of dkexp3 and dkexp4，increased and advanced the peak of their expression；treatment with 1-mcp showed a suppression of dkexp3 and dkexp4 expression in persimmon fruit，delayed and reduced the peak intensity. the peak expression levels of dkexp3 and dkexp4 in control fruits and 1-mcp treatment

9、fruits appeared earlier than those of the peak of ethylene production rate. the expression levels of exp genes were different in sarcocarp，pericarp and core. the results indicated that exp might play a role in the early stage of postharvest persimmon fruit ripening and softening progress. the expres

10、sion of exp genes is tissue-specific and regulated by ethylene. key words：persimmon；propylene；1-mcp；exp；real-time quantitative pcr 柿果實(shí)采后極易軟化，嚴(yán)重制約其貯藏保鮮和市場流通，使之不能充分發(fā)揮應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（付潤山 等，2010）。果實(shí)的軟化是由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成成分發(fā)生了變化（brummell & harpster，2001；brummell，2006；bennett & labavitc，2008）。exp（expansin，擴(kuò)展蛋白）是

11、一類細(xì)胞壁蛋白，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的松弛和伸展。近年來研究表明exp幾乎參與了植物生長發(fā)育的各個(gè)階段，在果實(shí)的成熟軟化上也起到重要的作用。目前已在番茄（rose et al.，1997）、獼猴桃（楊紹蘭 等，2007）、枇杷（yang et al.，2008）等果實(shí)中證明exp與果實(shí)的成熟軟化相關(guān)。為了更全面了解柿果實(shí)采后軟化的機(jī)制，對exp的研究不可或缺。本課題組已對柿果實(shí)exp進(jìn)行了克隆分析及原核表達(dá)測定，獲得了7個(gè)exp的基因序列（童斌 等，2005a；常曉曉 等，2010）。 本研究中以中國澀柿優(yōu)良品種富平尖柿（diospyros kaki l.fuping jianshi）為材料，利用乙

12、烯類似物丙烯（丙烯作用效應(yīng)約為乙烯的1%，代替乙烯處理果實(shí)，消除對內(nèi)源乙烯的干擾）和乙烯作用抑制劑1-mcp處理，研究exp在柿果實(shí)采后成熟軟化過程中的表達(dá)特點(diǎn)及作用，為研究柿果實(shí)的成熟軟化機(jī)制提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料及處理 富平尖柿果實(shí)于八成熟時(shí)（2012年10月12日）采自陜西省富平縣。采收當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選取成熟度一致、大小均一、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)作為試材。將果實(shí)隨機(jī)分成3組，一組密閉于含丙烯5 000 µl · l-1的容器中24 h，一組密閉于含1 µl · l-1 1-mcp的容器中24 h，另一組密閉于空白容

13、器中24 h作為對照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 kg果實(shí)。處理后通風(fēng)0.5 h，立即放入瓦楞紙箱，置于常溫中貯存。每3 d取樣1次，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。果實(shí)去皮后，果肉（不含果心部分）被迅速切成0.5 1 cm3的小塊用液氮速凍，置于80 超低溫冰箱保存，用于酶活性的測定及柿果實(shí)總rna的提取。另取剛采收未經(jīng)任何處理的富平尖柿果實(shí)，按果皮、果肉（中果皮，環(huán)繞種子外沿與果皮之間的部分）、果心（環(huán)繞種子外沿以內(nèi)部分，除種子以外）分別取樣并提取總rna，用于不同組織中dkexp3和dkexp4的相對表達(dá)量分析。 1.2 生理指標(biāo)測定 果肉硬度采用gy-1型硬度測定儀測定，每次隨機(jī)取9個(gè)果在胴部去

14、皮測定，當(dāng)果實(shí)硬度下降到 2 kg · cm-2停止取樣。乙烯釋放速率參照付潤山等（2010）的方法，使用trace gc uitra型氣相色譜儀法測定：載氣為n2，gdx-502色譜柱，柱長2 m，柱溫70 ，進(jìn)樣口溫度70 ，氫氣6期 孫振營等：柿采后丙烯和1甲基環(huán)丙烯處理對兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)的影響 1091 0.7 kg · cm-2，空氣0.7 kg · cm-2，氮?dú)?.0 kg · cm-2，進(jìn)樣量1 ml，氫火焰離子化檢測器檢測，檢測室溫度150 。acc合成酶（acs）和acc氧化酶（aco）活性的測定按照果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（曹建

15、康 等，2007）中的方法進(jìn)行，單位為nmol · h-1 · g-1。 1.3 exp基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析 參照童斌等（2005a）的方法提取柿果實(shí)總rna，并參照祝慶剛等（2012）的方法檢測提取的柿果實(shí)總rna并反轉(zhuǎn)錄。使用icycler iq5實(shí)時(shí)定量pcr儀器（bio-rad，美國）進(jìn)行rt-qpcr檢測。反應(yīng)體系為20.0 µl，含有10.0 µl sybr premix ex taqtm（takara），1.0 µl cdna，7.4 µl ddh2o，上、下游引物各0.8 µl（引物濃度10 µmo

16、l · l-1）。運(yùn)行程序?yàn)椋?5 預(yù)變性3 min，95 變性30 s，56 退火30 s，72 延伸30 s，40次循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。 在已獲得的7條exp基因中，以序列是否完整、同源性和獲得基因的果實(shí)時(shí)期為條件進(jìn)行篩選，最終選取了成熟期克隆得到的、已獲得全長序列的dkexp3（即cdk-exp3）和轉(zhuǎn)色期克隆得到的dkexp4（即cdk-exp4）（常曉曉 等，2010）為代表進(jìn)行測定。 以柿actin（zhang et al.，2012）作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物。參照dkexp3（genbank登錄號為：fj455264）和dkexp4（genbank登錄號為：fj472

17、608）的堿基序列設(shè)計(jì)特異性引物，具體引物序列見表1。 表1 實(shí)時(shí)熒光定量pcr使用的引物 table 1 primers used in real time quantitative pcr 目標(biāo)基因 target gene 引物名稱 primer name 引物序列（53） sequences of primers（53） dk-actin dk-actin（for） dk-actin（rev） ggattctggtgatggtgttag cagcagttgttgtgaaggagt dkexp3 dkexp3（for） dkexp3（rev） tcactgccactaacttctgc tc

18、ttattccaccctttttcac dkexp4 dkexp4（for） dkexp4（rev） acccaaaattggcattgaga aatatcaaaggtgaccccaac 用上述特異性引物進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)，獲得pcr產(chǎn)物，與目標(biāo)基因進(jìn)行比對，保證pcr產(chǎn)物為目標(biāo)基因上的片段。采用2-ct公式計(jì)算基因相對表達(dá)量（livak & schmittgen，2001），其中ct =（cttargetctactin）timex（cttargetctactin）time0。cttarget和ctactin分別是目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的ct值；timex和time0分別指取樣時(shí)間。相對

19、表達(dá)值的計(jì)算參照姜妮娜等（2010）的方法進(jìn)行。 1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異使用lsd法，并使用origin 8.5軟件進(jìn)行分析制圖。 2 結(jié)果與分析 2.1 丙烯和1-mcp處理對果實(shí)硬度的影響 硬度是反應(yīng)果實(shí)貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。圖1，a顯示，常溫貯藏過程中各處理果實(shí)硬度均呈下降趨勢。與對照相比，丙烯處理加速了果實(shí)硬度的下降，貯藏3 d即下降到6.65 kg · cm-2，僅為同期對照果實(shí)的59.64%，貯藏9 d即達(dá)到軟化（硬度值 2 kg · cm-2）。1-mcp處理顯著延緩了果實(shí)硬度下降，貯藏期間硬度始終高于對照，在貯

20、藏21 d時(shí)硬度下降為剛采收時(shí)的28.6%，顯著高于同期對照果實(shí)的硬度（p < 0.05）；最終于貯藏27 d達(dá)到軟化。 1092 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 2.2 丙烯和1-mcp處理對柿果實(shí)乙烯釋放速率的影響 乙烯釋放速率是反應(yīng)躍變型果實(shí)采后生理變化的重要指標(biāo)。圖1，b顯示，丙烯處理的果實(shí)乙烯釋放高峰提前，出現(xiàn)在貯藏3 d時(shí)（比對照提早9 d），其峰值極顯著（p < 0.01）高于其他處理，是對照峰值的1.9倍，是1-mcp處理果實(shí)的2.2倍。1-mcp顯著推遲果實(shí)乙烯高峰出現(xiàn)時(shí)間（貯藏18 d），且降低了乙烯高峰的峰值（為對照的87.73%）。 圖1 丙烯和1-mcp處理對柿果

21、實(shí)硬度（a）和乙烯釋放速率（b）的影響 fig. 1 effects of propylene and 1-mcp treatments on firmness（a）and ethylene release rate（b）of persimmon fruits 2.3 丙烯和1-mcp處理對柿果實(shí)acs和aco的影響 acs和aco是乙烯生成過程中的關(guān)鍵酶。圖2顯示，在貯藏過程中，對照果實(shí)的acs和aco的活性總體上表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。對照果實(shí)的acs活性升高（9 d）早于aco（12 d），但是兩者均在18 d后開始下降。丙烯處理促進(jìn)了acs和aco的活性升高，兩種酶均在貯藏3 d出現(xiàn)

22、高峰，隨后迅速下降；1-mcp處理抑制了兩種酶的活性，其活性始終低于對照果實(shí)。 圖2 丙烯和1-mcp處理對柿果實(shí)acs（a）和aco（b）的影響 fig. 2 effects of propylene and 1-mcp treatments on acs（a）and aco（b）of persimmon fruits 2.4 丙烯和1-mcp處理對柿果實(shí)的dkexp3和dkexp4表達(dá)的影響 圖3，a顯示，對照果實(shí)dkexp3的相對表達(dá)量在貯藏的前9 d迅速上升，9 d時(shí)為表達(dá)高峰，隨后緩慢下降。與對照相比，丙烯處理促進(jìn)了dkexp3的表達(dá)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在貯藏3 d時(shí)，較對照提前了6 d，

23、且峰值是對照峰值（9 d）的2.9倍；達(dá)到高峰后迅速下降，至貯藏結(jié)束時(shí)相對表達(dá)6期 孫振營等：柿采后丙烯和1甲基環(huán)丙烯處理對兩個(gè)擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)的影響 1093 圖4 富平尖柿果實(shí)dkexp3和dkexp4 在不同組織內(nèi)的相對表達(dá)的水平 fig. 4 relative expression level of dkexp3 and dkexp4 in different tissues offuping jianshi p < 0.05. 量降至1.3。1-mcp處理抑制了dkexp3的表達(dá)，貯藏3 d表達(dá)量下降為貯藏0 d的73.9%，隨后開始上升，但低于對照，至貯藏15 d達(dá)到表達(dá)高峰

24、，較對照推遲了6 d，峰值為對照峰值的79.2%；與對照相似，高峰出現(xiàn)后表達(dá)量下降速度較緩慢。 圖3，b顯示，dkexp4的相對表達(dá)量變化與dkexp3相似。但是丙烯處理的促進(jìn)作用小于對dkexp3的，表達(dá)高峰為對照高峰的1.9倍。1-mcp處理對dkexp4表達(dá)量的影響與對dkexp3的相似。 從以上結(jié)果可見，對照果實(shí)和1-mcp處理的果實(shí)中dkexp3 和dkexp4的相對表達(dá)量高峰均較乙烯釋放速率高峰早。 圖3 丙烯和1-mcp處理下柿果實(shí)dkexp3（a）和dkexp4（b）表達(dá)的水平 fig. 3 expression level of dkexp3（a）and dkexp4（b）i

25、n persimmon fruits treated with propylene and 1-mcp 2.5 柿果實(shí)不同組織中dkexp3和dkexp4表達(dá)的差異 如圖4所示。果心和果皮中dkexp3的相對表達(dá)量相近，均顯著低于果肉（p < 0.05），dkexp4的相對表達(dá)量在果心中最高，果肉次之，在果皮中最低，三者差異顯著（p < 0.05），表明柿果實(shí)中dkexp3和dkexp4的表達(dá)具有組織特異性。 3 討論 作為一類細(xì)胞壁蛋白，exp幾乎參與了植物體所有的生長發(fā)育過程（張娟 等，2011）。exp在果實(shí)成熟軟化過程中發(fā)揮著特定的作用。自從rose等（1997）發(fā)現(xiàn)一個(gè)-

26、expansin基因leexp1在番茄后熟期特異性表達(dá)以來，先后利用反義技術(shù)（brummell et al.，1999）、northern雜交（楊紹蘭 等，2007）、實(shí)時(shí)熒光定量（牛艷梅 等，2008；gaete-eastman et al.，2009）等技術(shù)手段對果實(shí)中的exp基因進(jìn)行了研究，均表明exp部分成員與果實(shí)的成熟軟化相關(guān)，且受乙烯的調(diào)控。目前1094 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 尚沒有化學(xué)方法能夠測定exp的活性，利用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析轉(zhuǎn)錄水平上exp的表達(dá)特點(diǎn)顯得尤為必要。 本試驗(yàn)中，與對照果實(shí)相比，丙烯處理硬度下降迅速，乙烯高峰提早且升高，acs、aco活性受到促進(jìn)；而1-m

27、cp處理果實(shí)，硬度下降減慢，延長了果實(shí)的貯藏期，乙烯高峰推遲且降低，acs、aco活性受到抑制。與對照相比，丙烯處理促進(jìn)dkexp3和dkexp4的表達(dá)，相對表達(dá)量高峰提前了6 d，峰值有顯著升高；1-mcp處理的高峰推遲，峰值顯著低于對照，且總體水平有所降低。可見，dkexp3和dkexp4的表達(dá)受乙烯調(diào)控，在乙烯大量存在的情況下，其表達(dá)水平也迅速提高；而在乙烯合成受抑制時(shí)，其表達(dá)水平提高的速率也相對降低。在貯藏后期，隨著內(nèi)源乙烯的不斷生成，乙烯受體蛋白逐漸消耗，果實(shí)對1-mcp敏感度減低（zhang et al.，2011）。本試驗(yàn)中，對照和1-mcp處理果實(shí)的dkexp3和dkexp4的

28、均較對應(yīng)的乙烯高峰出現(xiàn)提前，這與楊紹蘭等（2007）在獼猴桃上的研究成果相似。已有證據(jù)表明，盡管exp自身缺乏水解酶活性，但它卻能提高纖維素酶對纖維素的水解活性。這種相互促進(jìn)作用表明exp使微纖維表面的葡聚糖對纖維素酶的攻擊更加敏感（童斌 等，2005b；金漫 等，2010）。這表明dkexp3和dkexp4與柿果實(shí)成熟軟化有一定的關(guān)系，尤其是在乙烯躍變高峰來臨之前的作用較重要。 本試驗(yàn)中，富平尖柿未處理果實(shí)的dkexp3和dkexp4相對表達(dá)量在果皮、果肉、果心中存在顯著差異，表明exp存在組織特異性。貯藏過程中觀察到果實(shí)各組織的軟化先后順序?yàn)楣淖钤?，果肉次之，果皮最晚，這可能與擴(kuò)展蛋白的

29、特異性表達(dá)有關(guān)，但仍需要結(jié)合其他水解酶活性變化特點(diǎn)的研究進(jìn)一步證實(shí)。 通過以上分析，推測柿果實(shí)中與成熟有關(guān)的dkexp3和dkexp4主要在果實(shí)的成熟軟化前期起作用；其表達(dá)有組織特異性，且受到乙烯的調(diào)控，但其信號傳遞路徑尚不明確。要全面了解exp在柿果實(shí)成熟軟化過程中的調(diào)控機(jī)制，特別是與其他細(xì)胞壁水解酶的相互作用以及對其他植物激素的反應(yīng)如何，還需要更深入的研究。 references bennett a b，labavitc j m. 2008. ethylene and ripening-regulated expression and function of fruit cell wall

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