第三章線粒體功能及其相關毒性作用

1、線粒體及其相關毒性作用高度動態(tài)的細胞器：線粒體的大小、數量和分布反應了細胞對能量的需求。 線粒體的基本結構 線粒體外膜 外膜上分布有孔蛋白（porin）構成的桶裝通道，直徑2-3nm，當孔蛋白通道完全打開時，可以通過相對分子質量高達5000的分子。 ATP 、NAD、輔酶A等相對分子質量小于1000的物質均可自由通過外膜。因此，外膜的通透性很高，膜間空間中的離子環(huán)境幾乎與胞質相同。線粒體內膜 內膜具有很高的蛋白質/脂質比，缺乏膽固醇，富含心磷脂。 內膜具有極高的不透性，因此限制了所有分子和離子的自由通過，是質子電化學梯度的建立以及ATP合成所必須的。 線粒體內膜上的蛋白主要執(zhí)行三種功能： 1）

2、電子傳遞鏈；2）ATP合成；3）轉運蛋白。線粒體膜間隙膜間隙的寬度通常為6-8nm，在呼吸活躍時，膜間隙可顯著擴大。含有可溶性酶類、底物以及輔助因子。其含有的腺苷酸激酶可以催化ATP分子末端磷酸基團轉移到AMP，生成ADP。線粒體基質線粒體基質富含可溶性蛋白膠狀物，具有穩(wěn)定的pH和滲透壓。具有催化三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化和氨基酸降解的相關酶類。含有DNA、RNA 、核糖體。 線粒體的分離外膜磷脂合成脂肪酸的去飽和化脂肪酸鏈的延伸標志酶：單胺氧化酶內膜電子傳遞氧化磷酸化代謝中間物的轉運標志酶：細胞色素氧化酶基質丙酮酸氧化三羧酸循環(huán)脂肪酸的氧化DNA復制、RNA轉錄蛋白質翻譯標志酶：蘋果酸脫氫酶膜間

3、空間核苷酸的磷酸化標志酶：腺苷激酶線粒體產能（ATP）示意圖6糖糖丙酮酸丙酮酸脂肪脂肪脂肪酸脂肪酸CoA三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)TCANADH或或FADH2電子傳遞到電子傳遞到氧生成水氧生成水形成質子電化形成質子電化學梯度學梯度ATP合成酶合成酶合成合成ATP線粒體內膜丙酮酸載體 線粒體是糖類、脂類和蛋白質最終氧化釋能的場所，TCA是物質氧化的最終共同途徑，氧化磷酸化是生物體獲得能量的主要途徑。（一）線粒體中的氧化代謝n在電子傳遞的過程中，接受和釋放的電子的分子和原子被稱為電子載體。n由電子載體組成的電子傳遞序列被稱為電子傳遞鏈。n五種類型電子載體：黃素蛋白、細胞色素、泛醌、 鐵硫蛋白和銅原子。除

4、泛醌外，其他氧化還原中心都是與蛋白質相連的輔基。n呼吸鏈中的電子載體有嚴格的排列順序和方向，按氧化還原電位由低向高排列(NAD+/NADH最低，O2/H2O最高）。（二）電子傳遞鏈與電子傳遞9n電子傳遞復合物，組成兩種呼吸鏈：NADH呼吸鏈, FADH2呼吸鏈，電子傳遞鏈各組分在線粒體內膜上不對稱分布。電子傳遞復合物n復合物：NADH-CoQ還原酶（既是電子傳遞體又是質子移位體） 組成：含42個蛋白亞基，至少6個Fe-S中心和1個黃素蛋白。 作用：催化1對電子從NADH輔酶Q； 泵出4 H+n復合物：琥珀酸-CoQ還原酶（是電子傳遞體而非質子移位體） 組成：含FAD輔基，2Fe-S中心， 作用

5、：催化1對低能電子FADFe-S輔酶Q (無H+泵出)n復合物：CoQ- Cyt c還原酶（既是電子傳遞體又是質子移位體） 組成：包括1個cyt c1、1個cyt b、1個Fe-S蛋白作用：催化電子從UQH2cyt c；泵出4 H+ （2個來自UQ，2個來自基質） n復合物：細胞色素c氧化酶（既是電子傳遞體又是質子移位體）組成： 二聚體，每一單體含13個亞基，三維構象， cyt a, cyt a3 ,Cu, Fe 作用：催化電子從cyt c分子O2 形成水，2 H+泵出， 2 H+ 參與形成水n 線粒體承擔的能量轉換實質上就是把H+跨膜電位差和質子濃度梯度形成的質子驅動力轉換成ATP分子中的高

6、能磷酸鍵。n TCA循環(huán)提供的質子驅動力和高能電子是線粒體合成ATP的基本能源。（三）質子轉移與驅動力的形成Ca2+調控n 氧化(電子傳遞、放能)與磷酸化(ADP+Pi，儲能)同時進行，密切耦聯，分別由兩個不同的結構體系實現。n 用超聲波將線粒體破碎，線粒體內膜碎片可自然卷成顆粒朝外的小膜泡，這種小膜泡稱為亞線粒體小泡或亞線粒體顆粒。（四）ATP形成機制氧化磷酸化ATP合酶的結構與組成n ATP合酶是最終生成ATP的裝置。它分布于細菌質膜、線粒體內膜和葉綠體類囊體膜上。n ATP合酶的分子由球形的頭部和基部組成。 線粒體主要功能是高效地將有機物中儲存的能量轉換為細胞生命活動的直接能源ATP；與

7、細胞中氧自由基的生成，調節(jié)細胞氧化還原電位和信號轉導、調控細胞凋亡、細胞內多種離子的跨膜轉運及電解質穩(wěn)態(tài)平衡。 線粒體功能小結 線粒體的損傷線粒體滲透轉變細胞內Ca2+異常ATP合成酶異常自由基的產生和積累原發(fā)性代謝紊亂的相互作用線粒體DNA異常線粒體滲透轉變(MPT)1.線粒體攝取Ca2+、滲透勢下降，ROS和RNS生成、ATP耗竭和原發(fā)性代謝紊亂都會引起線粒體內膜通透性（MPT）突然升高。2.MPT是一種跨越線粒體內外膜間的蛋白質孔（巨通道）開放引起的。這個通道對于分子質量小于1500的溶質可通透，它的開放使質子自由的內流進入，引起膜電位迅速和完全耗散、ATP合成的中斷以及水的滲透內流，導

8、致線粒體膨脹，已經蓄積于基質間隙的Ca2+通過此孔大量流出，進入細胞質。這樣的線粒體不僅不能合成ATP，而且由于內膜的去極化迫使ATP合酶以相反的模式（水解ATP）將余留的能源全部耗盡。如果細胞中大部分或全部的線粒體都發(fā)生滲透轉變，細胞溶解壞死將達到巔峰。在動物細胞線粒體膜上存在滲透性轉換孔（PTP），當PTP開放時，線粒體內膜對中低分子量的化合物的滲透性會突然增加，從而導致線粒體基質中分子量小于1.5kD的游離物質滲透進入膜間空間，這個過程稱為線粒體滲透性轉換（mitochondrion permeability transition,MPT）。細胞內的鈣庫細胞內儲存Ca2+庫包括肌質網、線

9、粒體，負責肌細胞細胞質中鈣離子的調節(jié)，心肌細胞去極化時釋放鈣離子，復極化時攝取鈣離子。心衰時，肌質網功能障礙的原因之一是能量的缺乏，ATP依賴的Ca2+泵功能降低，導致心肌復極化時不能有效攝取鈣離子，去極化時又不能及時釋放鈣離子。線粒體在正常情況下可以攝取細胞總Ca2+量的20%，這與線粒體中生物氧化酶的功能有關，在心衰出現時，細胞內pH的改變影響線粒體內Ca2+穩(wěn)態(tài)，使線粒體攝取鈣離子增多，當Ca2+超載時，引起線粒體功能障礙。19Ca2+濃度的持續(xù)升高1.高血壓：Ca2+釋放的增加使更多的鈣離子進入平滑肌細胞，同時還促進了細胞內儲存Ca2+的釋放，細胞內儲存鈣的釋放再加上細胞外鈣離子的內流

10、可引起血管平滑肌的收縮，且影響細胞的生長，造成血管肥大，導致結構性和功能性外周阻力增高，血壓增高。2.帕金森?。涸谡Ｇ闆r下，神經元中持久的鈣離子信號轉到的影響是受到線粒體Ca2+釋放和累積的調節(jié)，定位于線粒體內膜上的呼吸鏈蛋白復合體，從線粒體機制排出質子，產生一個150v-180mv（內側負）的線粒體膜電位，這個電化學梯度驅動了ATP的合成并且提供了Ca2+在線粒體內側的轉運。在PD病人中，線粒體功能異常使鈣離子超載，導致多巴胺神經元更加興奮。ATP合酶的工作特點：可逆性復合酶ATP耗竭1.主要的能量物質，參與生物合成以及磷酸化、肌肉收縮、細胞骨架聚合、細胞運動、細胞分裂、膜泡轉運。2.質膜

11、和內質網膜上的鈣泵、溶酶體膜質子泵等多種離子泵功能失常。3.線粒體功能的異常：氧化磷酸化過程受到損害，ADP堆積，ATP耗竭，細胞內酸中毒、離子堆積，細胞容量調節(jié)失控，最終導致細胞膜的不可逆損傷。自由基的產生 自由基：自由基是指能夠獨立存在的具有一個或者多個不配對電子的任何核素（原子、原子團、分子，species），具有很高的化學活性。在生物體中最重要的自由基是活性氧（ROS, reactive xoxygen species），尤其是超氧陰離子（O2-）和羥自由基（OH.）以及分子氧，自由基極易給出電子或者俘獲電子。 分類： 可以分為氧自由基和脂自由基。 從活性氧角度可以分成氧自由基、過氧化

12、物（過氧化氫、氫過氧化物）、激發(fā)態(tài)氧。22自由基的產生 線粒體：是氧自由基生成的主要場所之一，作為線粒體正常代謝的副產品，自由基在線粒體內會不斷積累產生。在氧化磷酸化的過程中，有1%-5%的氧會逃離正常的細胞色素氧化酶催化過程，經過非催化形式，逐步的非共價還原形成自由基，主要是超氧陰離子和過氧化氫，在線粒體呼吸鏈中，還原性的CoQ、黃素蛋白、細胞色素C等均可產生超氧陰離子。23自由基的正常功能代謝儲能：體內約17%的自由基是在氧代謝的過程中產生的。如ATP合成。轉化排泄：體內代謝產物、外源性的藥物及毒物從體內清除是，均需在加單氧酶系作用下經過羥化反應，經尿或者膽汁排出。防御殺菌和抗腫瘤：吞噬細

13、胞在吞噬活動中被激活，耗氧量增加顯著，即所謂呼吸爆發(fā)。所攝取的氧大部分產生過氧化氫、超氧陰離子以殺滅微生物、寄生蟲并且可以破壞癌細胞，進一步氧化，可以消化被吞噬的異物。阿霉素通過轉化形成自由基破壞癌細胞DNA（同時損傷正常細胞）。24自由基損害作用對脂類的作用：生物膜中的不飽和脂肪酸受到自由基的作用而轉變成過氧化脂質，從而導致膜的流動性改變，膜流動性下降導致細胞脆性增加、膜受體、離子通道異常，變形能力下降，出現動脈粥樣硬化等，同樣線粒體膜和溶酶體膜的脂質過氧化反應也會出現相同的后果，并且脂質過氧化會誘發(fā)新的自由基的產生。對蛋白質的作用：會造成蛋白質的交聯、聚合和肽鏈的斷裂，也可以使蛋白質和脂類

14、結合形成聚合物，是蛋白質喪失功能。25自由基損害作用對核酸的作用：自由基作用于DNA，與堿基發(fā)生加成反應，造成對堿基的修飾，從而引起基因突變；也可以引起DNA鏈的斷裂，以及染色體畸變和染色體斷裂。對細胞外基質的破壞：氧自由基可以使細胞外基質中膠原纖維的膠原蛋白發(fā)生交聯，使透明質酸降解，從而引起基質變得疏松，彈性下降，出現皺紋。心肌缺血再灌注：狗冠狀動脈結扎-突然松開恢復灌流-室顫死亡。缺血為自由基的形成提供了有利條件，再灌流則像是加入了催化劑使自由基瞬時大量生成。應預先給予自由基清除劑。26三種原發(fā)性代謝紊亂的相互作用促進產生ROS/RNS 線粒體的損傷n 在醫(yī)學上，由線粒體功能障礙引起的疾病

15、稱為線粒體病。n 線粒體疾病都為母系遺傳。n 外界環(huán)境因素對線粒體功能的影響：克山病。n 細胞中線粒體的數量隨年齡增長而減少，而體積卻隨年齡增長而增大。n 人類線粒體疾病其原發(fā)機制都是mtDNA異常（突變、缺失、重排）引起的遺傳性疾病，表現為電子傳遞酶系和氧化磷酸化酶系的異常。n 誘導因素之一為氧自由基，機體衰老即退行性疾病時，Mn-SOD活性降低，氧自由基就積累在線粒體中，從而導致多種疾病的發(fā)生。n 氧自由基造成mtDNA氧化損傷的積累量可比核DNA高16倍，同時mtDNA不具有核基因的修復裝置，因此mtDNA發(fā)生突變的頻率比細胞核高10倍以上。 線粒體損傷的檢測線粒體膜勢能檢測1.線粒體在

16、細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現之前，一旦線粒體崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。2.線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。線粒體膜勢能的檢測1.線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現之前

17、，一旦線粒體崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。2.線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。3.JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜勢能的檢測4. JC-1單體的最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。通常可以CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。5. 線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1