4TA連接,感受態(tài)細胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選

1、 1. pcr產(chǎn)物與產(chǎn)物與t載體的連接載體的連接 2.感受態(tài)細胞的制備，感受態(tài)細胞的制備， 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化實驗一、實驗一、pcr產(chǎn)物與產(chǎn)物與t載體的連接載體的連接t vector 1 l10ligation buffer 1 lpcr回收產(chǎn)物回收產(chǎn)物 7 lt4 dna ligase 1 l輕彈管底混合，離心機甩一下，置輕彈管底混合，離心機甩一下，置2525o oc c水浴水浴1212h h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置-20-20o oc c保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。（低溫連接效果比室溫好）（低溫連接效果比室溫好）。1. 連接反應(yīng)連接反應(yīng)2.

2、ta克隆原理克隆原理 tagdna 聚合酶的一個功能：聚合酶的一個功能： 使使pcr產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端突出一個端突出一個a。3 aa 3553 tt 355 商業(yè)設(shè)計的商業(yè)設(shè)計的t載體：在載體：在3端多出一個端多出一個t。 兩者的粘性末端可以互補配對。兩者的粘性末端可以互補配對。應(yīng)用時避免反復(fù)凍融，防止應(yīng)用時避免反復(fù)凍融，防止t的斷裂丟失。如果與的斷裂丟失。如果與t載體連接載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮后主要以自身環(huán)化為主，要考慮t可能已經(jīng)丟失?？赡芤呀?jīng)丟失。其他說明：其他說明：1 1） 連接反應(yīng)的連接反應(yīng)的關(guān)鍵關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體

3、比例為片段與載體比例為2:1 2:1 或或3:13:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。定比例。2 2）平端連接）平端連接 平端連接通常需要先將載體的平端連接通常需要先將載體的5 5 端磷酸去掉，然后再進端磷酸去掉，然后再進行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。 當載體的當載體的5 5 端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會留下端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會留下一個缺口，連接酶由于載體一個缺口，連接酶由于載體5 5 端缺乏磷酸而無法形成磷酸二端缺乏磷酸而無法形成磷酸二酯鍵，酯鍵， 轉(zhuǎn)化入細胞后，細胞內(nèi)的酶會將缺乏的磷酸基團加上，轉(zhuǎn)化入

4、細胞后，細胞內(nèi)的酶會將缺乏的磷酸基團加上，再形成磷酸二酯鍵。再形成磷酸二酯鍵。 實驗二、感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗二、感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌在低滲培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌在低滲 caclcacl2 2 存存在的情況下，細菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。在的情況下，細菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。 另外，鈣離子溶液處理的細胞對外源另外，鈣離子溶液處理的細胞對外源dnadna的攝的攝取能力增強。取能力增強。1. 感受態(tài)細胞制備原理感受態(tài)細胞制備原理2.2.注意事項：注意事項：1 1）感受態(tài)細胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。）感受態(tài)細胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。

5、如果反復(fù)凍融會使細胞活力受影響，而且細胞膜如果反復(fù)凍融會使細胞活力受影響，而且細胞膜的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細胞狀態(tài)，失去接受外源胞狀態(tài)，失去接受外源dnadna的能力。的能力。2 2）無菌操作。）無菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。 各種器具均需消毒各種器具均需消毒。無菌操作的注意事項無菌操作的注意事項 槍頭、槍頭、ep管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過高壓滅高壓滅菌菌后在超凈臺中專用的，但加樣器需要自帶。后在超凈臺中專用的，但加樣器需要自帶。取飯盒中的

6、槍頭、取飯盒中的槍頭、ep管時，都要用在酒精燈上燒灼后的管時，都要用在酒精燈上燒灼后的鑷子夾取鑷子夾取。燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要在在酒精燈上燒灼一下瓶口酒精燈上燒灼一下瓶口。塑料制品，如槍頭和塑料制品，如槍頭和ep管不能用酒精燈燒灼。管不能用酒精燈燒灼。手臂盡量手臂盡量不要在敞開的容器上方移動不要在敞開的容器上方移動，以免落入雜菌。，以免落入雜菌。超凈臺事先要打開超凈臺事先要打開紫外燈照射至少紫外燈照射至少20 min進行消毒，使進行消毒，使用時要打開風機，。用時要打開風機，。操作前要用操作前要用酒精擦拭手臂或帶手套酒精擦

7、拭手臂或帶手套。無菌超凈工作臺無菌超凈工作臺1 1） 將大腸桿菌在將大腸桿菌在lblb瓊脂培養(yǎng)基上劃線，瓊脂培養(yǎng)基上劃線，3737o oc c12-12-1616小時。小時。2 2） 次日從瓊脂平板上取一單菌落于次日從瓊脂平板上取一單菌落于2 2ml lbml lb培養(yǎng)培養(yǎng)基中，基中，3737o oc c，225rpm225rpm速度震蕩培養(yǎng)速度震蕩培養(yǎng)12-1612-16小時。小時。3 3） 取取1 1mlml上述培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)物接種于100100ml lbml lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737o oc c， 225rpm 225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至的速度震蕩培養(yǎng)直至odod值為值

8、為0.50.5左右左右( (約約3 3小時小時) )。 （上述（上述1 13 3步驟已經(jīng)由實驗室完成）步驟已經(jīng)由實驗室完成）水浴搖床水浴搖床 3. 感受態(tài)細胞的制備過程感受態(tài)細胞的制備過程5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul 冰冷的冰冷的 100mmol/l cacl2 致敏液懸浮細胞，冰浴致敏液懸浮細胞，冰浴5分鐘。分鐘。6）6000rpm，離心離心5分鐘，回收細胞，棄上清，加分鐘，回收細胞，棄上清，加 入入100ul冰冷冰冷100 mmol/l cacl2溶液，懸浮細胞。溶液，懸浮細胞。7）4oc可保存可保存1-2周；長期保存，周；長期保存， 可加甘

9、油至終濃可加甘油至終濃 度為度為15%，置，置-70oc備用。備用。注意：（無菌操作）注意：（無菌操作）4） 取取1ml 菌液冰浴菌液冰浴5min，然后然后6000rpm，離心離心5 min ，收集菌體。，收集菌體。1 1）將）將200200 l l感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞置冰上融化置冰上融化，然后加入，然后加入3 3 l l dmsodmso, , 混合后，加入混合后，加入1010 l l連接反應(yīng)液連接反應(yīng)液( (含重組質(zhì)粒含重組質(zhì)粒), ), 溫和混勻，置冰上溫和混勻，置冰上1010分鐘分鐘。 ( (目的：防止細胞被脹破。目的：防止細胞被脹破。) ) 2）42oc，45秒，秒，然后然后迅速放回冰中迅速放回冰中1-2分鐘。分鐘。1. 轉(zhuǎn)化的實驗步驟轉(zhuǎn)化的實驗步驟3）加入）加入1 ml lb培養(yǎng)液，培養(yǎng)液， 37oc，225rpm搖蕩培搖蕩培養(yǎng)養(yǎng)30min。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 4） 6,000rpm，離心離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約秒鐘，倒掉上清，用剩余的約 200 l lb培養(yǎng)液重懸菌體。培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，）將殘存菌液輕輕混勻， 鋪于含有氨基芐青霉素的鋪于含有氨基芐青霉素的 lb瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫