27動物基因工程

1、第七節(jié)第七節(jié) 動物基因工程動物基因工程d 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移 本章內(nèi)容：c 高等哺乳動物的載體系統(tǒng)b 高等哺乳動物的受體系統(tǒng)a 高等哺乳動物基因工程的基本概念e 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白a 高等哺乳動物基因工程的基本概念高等哺乳動物基因工程高等哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細(xì)胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型b 高等哺乳動物的受體系統(tǒng)高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性正常的哺乳類動物細(xì)

2、胞具有下列四大生物學(xué)特征： 錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂 血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長 接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制 形態(tài)依賴性：細(xì)胞呈扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞生長。有時，正常細(xì)胞會改變某些特征而越過生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞成為細(xì)胞系。高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件 細(xì)胞系特征 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大 遺傳穩(wěn)定性 外源基

3、因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存 合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持 生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制 規(guī)模培養(yǎng) 大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能 安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（tk）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（hat培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（hprt -）不能在含有次黃嘌呤核苷

4、、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（hat培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補(bǔ)哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理aph- 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 g418 aph滅活g418dhfr 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 dhfr變體抗氨甲喋呤 hph- 潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素b hph滅活潮霉素b tk- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 tk合成tmpxgprt- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 xgprt合成gmpada- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ada滅活xyl-a 常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞 迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)

5、模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（cho），其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國fda確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（gras）c 高等哺乳動物的載體系統(tǒng)人腺病毒dna猴空泡病毒dna（sv40）人乳多瘤病毒dna（bkv）人牛痘病毒dna人腺病毒dna 腺病毒科為線狀雙鏈dna病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒腺病毒的生物學(xué)特性有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是c亞屬的2型（ad2）和5型（ad5）病毒。

6、 腺病毒感染人細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。基因重排低 外源基因與病毒dna重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期腺病毒dna載體的特點(diǎn)安全性能好 不整合人的染色體dna，不會導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達(dá)猴多瘤病毒dna（sv40） sv40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀dnasv40的生物學(xué)特性sv40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白h2、h3、h4結(jié)合，從而使其dna形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

7、 sv40感染猴細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。sv40的基因組dna t / t基因編碼病毒的小抗原和大sv40 dnaorivp2tvp3vp1t抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān) sv40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有105個病毒dna拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白sv40 dna-質(zhì)粒dna雜合載體的構(gòu)建 重組的sv40 dna分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源dna片段不能太大。為了盡量提高sv40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的sv40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。a

8、proriviral genegptsv40 oripv2-gptpbr322pbr322sv40 pv2-gpt是一種sv40 dna與大腸桿菌質(zhì)粒dna雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子（霉酚酸）。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔- 珠蛋白.利用sv40 dna載體表達(dá)外源基因的程序sv40 載體病毒晚期基因啟動子篩選標(biāo)記ori缺陷的sv40 輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒dna轉(zhuǎn)化篩選增殖感染基因表達(dá)好 外源基因能高效表達(dá)sv40 dna載體的特點(diǎn)基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄 只

9、能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小人乳多瘤病毒dna（bkv） 人乳多瘤病毒（bkv）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈dna，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性主復(fù)制，每個宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個拷貝人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建bkv - e.coli 穿梭載體bkv oribkv genedremmtpap re.coli orisv40 pneo r刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素p450 dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子dre，控制小鼠乳腺癌啟動子mmtp

10、，由其帶動外源基因的表達(dá)。sv40來源的啟動子控制neor 標(biāo)記基因，以g418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒b蛋白獲得成功。人牛痘病毒dna 人牛痘病毒是一個大型dna病毒，基因組長185 kb，能在宿主細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建人牛痘病毒的生物學(xué)特性出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外dna重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。 目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌t7rna聚合

11、酶編碼基因。在人牛痘病毒dna表達(dá)載體的構(gòu)建外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)t7rna聚合酶，然后再將含有外源基因和t7啟動子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體dna上，并在t7rna聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。 人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序牛痘病毒啟動子t7 rna聚合酶基因t7啟動子外源基因細(xì)菌重組質(zhì)粒感染轉(zhuǎn)化培養(yǎng)收集d 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因

12、表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體dna上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。 將待轉(zhuǎn)化的dna溶解在磷酸緩沖液中，加入cacl2溶液混勻，此時dna被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，dna便進(jìn)入受體細(xì)胞；磷酸鈣共沉淀法 將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37保溫4-16小時 棄去dna溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。 如果在外源dna中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性dna可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒dna，可

13、使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。 將待轉(zhuǎn)化的dna溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時 電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。電擊轉(zhuǎn)化法dna片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。 將待轉(zhuǎn)化的dna溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相dna的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。合，dna隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。 利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和hela脂質(zhì)體介導(dǎo)法 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜融細(xì)胞。 通過激素療

14、法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；性原核內(nèi)。 上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細(xì)胞逐一操顯微注射法 借助于顯微鏡將純化的dna溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。 血影細(xì)胞是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞同時，外源dna也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源dna轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞介導(dǎo)法核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融

15、合，從而將外源dna轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒dna為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家禽和牲畜細(xì)胞等。e 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子viii哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。

16、氨甲喋呤（mtx）是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因（dhfr）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的dna區(qū)域同時被擴(kuò)增。通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因dhfr-mtx高效表達(dá)系統(tǒng)外源基因dhfr轉(zhuǎn)染dhfr -細(xì)胞系單克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)移0.05 m mm mtx培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)移

17、5 m mm mtx0.25 m mm mtx培養(yǎng)單克隆外源基因擴(kuò)增至100拷貝通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因gs-msx高效表達(dá)系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（gs）能解除甲硫氨酸亞砜（msx）對動物細(xì)胞的毒害作用。先將帶有g(shù)s編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)中不必使用gs缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的msx濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是gs-msx系統(tǒng)比dhfr-胞中，由于只有多拷貝的gs編碼基因才能抗msx，所以在轉(zhuǎn)染過程mtx系統(tǒng)優(yōu)越之處。通過強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因 在載體上安裝病毒或細(xì)胞來源的強(qiáng)啟ap rm13 oricole1 oricmvppolylinker

18、geneintronsv40 tpolya signal高效表達(dá)載體mrna前體aaaaaaaaamrna動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如： 細(xì)胞巨化病毒cmv的啟動子 動物珠蛋白基因的內(nèi)含子 sv40的終止子和polya化信號序列 絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙rna前體的剪切能促進(jìn)成熟mrna向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白 迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b 干擾素g 干擾素凝血因子viii凝血因子ix促紅細(xì)胞

19、生成素（epo）生長因子（hgh）白介素 2（il-2）乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 cd4受體組織型纖溶酶原激活劑（tpa）利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴neor鼠金屬硫蛋白啟動子b 肌動蛋白啟動子抗體輕鏈cdnab 肌動蛋白終止子pldhfrsv40啟動子b 肌動蛋白啟動子抗體重鏈cdnab 肌動蛋白終止子ph瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用dhfr-mtx系統(tǒng)表達(dá)。利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑 第一個由重組哺乳動物dhfr啟動子人tpa cdna終止子細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶