分子生物學輔導筆記

1、（前4章注意概念就行了，重點是轉座子，RNA編輯）Chapter1真核生物基因組結構與功能的特點本章應掌握的基本概念 細胞核基因組的大?。?C值矛盾； 重復序列； 基因家族； 真核基因的斷裂結構 基因家族（gene family) 指核苷酸序列或編碼產物的結構具有一定程度同源性的一組基因。假基因（pseudogene) 在多基因家族中有的成員并不能表達出有功能的產物。 1、核酸序列相同：即為多拷貝基因如rRNA基因家族，tRNA基因家族，組蛋白基因家族。 2、核酸序列高度同源：如人類生長激素基因家族包括三種激素的基因，人生長激素、人胎盤促乳素和催乳素，它們之間高度同源。 3、編碼產物有同源功能

2、：基因序列的相似性可能較低，但基因編碼的產物具有高度保守的功能區(qū)。如src癌基因家族 4、編碼產物具有小段保守基序：有些基因家族中各成員的DNA序列可能不明顯相關，而所編碼的產物卻有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序?；虺易澹╣ene superfamily) 指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族，它們的結構有不同的同源性，但功能并不一定相同。如免疫球蛋白基因超家族。真核基因的斷裂結構斷裂基因（split gene) 基因與基因間的非編碼序列為間隔DNA（ spacer DNA).內含子（intron）無編碼意義的DNA片段外顯子（extron）具有編碼意義的DNA片段Ch

3、apter2 葉綠體基因組 本章應掌握的基本概念 葉綠體DNA的信息含量； 葉綠體基因組的結構； 葉綠體基因的組成；（記憶每個大標題，了解就可以了） 葉綠體基因的一些結構特征。 p33. RNA編輯Chapter3線粒體基因組 本章應掌握的基本概念 線粒體基因組的大?。?線粒體基因組的組織結構； 線粒體基因組的組成； 線粒體基因的一些特征； p44. RNA編輯；（注意概念，分類，意義） 遺傳信息在基因組之間的流動。（適當關注） Chapter4可移位遺傳因子 本章應掌握的基本概念 可移位因子的類型； 轉座子； LTR逆轉錄轉座子； 無LTR逆轉錄轉座子；轉位因子(transposable e

4、lement) 可移動的基因成分，指能在一個DNA分子內部或兩個DNA分子之間移動的片段。在細菌中可指在質粒和染色體之間或在質粒和質粒之間移動的片段。 轉位因子的主要類型 插入序列（insertion sequence,IS) 轉座子（transposon,Tn) 逆轉錄轉座子（retroposons or retro transposon ） 轉座的噬菌體（transposable phage )插入序列(Insertion sequence) 一類簡單轉位因子，長度約7002000bp，由一個轉位酶基因及兩側的反向重復序列（inverted repeat sequence, IR)組成，不

5、帶任何其它基因。轉位時復制宿主靶位點一小段DNA（415bp）形成兩端的正向重復序列。轉座子（transposon,Tn) 一類較大的可移動成分。除有關轉座的基因外，至少帶有一個與轉座作用無關并決定宿主菌遺傳性狀的基因。轉座子中的轉位酶常稱為轉座酶，其功能是介導轉座子插入到DNA的其它部位。轉座子與基因表達的關系：插入編碼區(qū)，插入5側向序列，可在不同植物中起作用1984年McClintock（巴巴拉麥克林托克）就提出轉座子在植物基因組的重建中起著很重要的作用。轉座子在調節(jié)和編碼區(qū)域的插入和切除都能改變基因的編碼功能和表達模式，但在抗病基因分子生物學的研究中，尚未有證據直接證明抗病基因座中新的專

6、化性抗性基因的產生是由轉座子的插入或切除所致。不過已有試驗表明，由轉座子誘發(fā)的基因改變能引起抗病基因的失活和多樣化。轉座子通常會造成破壞，而在本例中，它們看來對寄主有利。加州大學戴維斯分校進化遺傳學家 和同事 偶然間發(fā)現(xiàn)果蠅加州種群體內有一條含萬個堿基對的染色體片段，所包含的全部基因不存在個體差異。原因可能是該相同區(qū)域中某個特別的等位基因迅速擴散到了整個種群，同時捎帶上它附近的各等位基因基因，它與一個“跳躍基因”相連，負責清除殺蟲劑和其他毒物的毒性。試驗表明，當轉座子存在時，基因比較活躍，這可能是由于跳躍過程打開了某個“基因開關”，而基因通常是處于關閉狀態(tài)的。逆轉錄轉座子（retroposon

7、s or retrotransposon ）： 逆轉錄轉座子又稱“反轉位子”。這些流動的遺傳元素首先被轉錄成RNA，然后再被由該反轉位子本身產生的一種逆向轉錄酶重新轉變成DNA。該DNA版本可在任何位置結合進基因組中。LTR逆轉錄轉座子 p58：在結構、轉錄特性和轉座機制上十分類似于逆轉錄病毒的原病毒，在其兩端具有長的同相重復序列（LTRs）無LTR逆轉錄轉座子 p63：有與逆轉錄轉座子類似的序列結構，但兩端缺少長的同相重復序列。典型的例子是長散布元件（long interspersed element，LINE）轉座的噬菌體（transposable phage ) ：具有轉座功能的溶源性噬

8、菌體Chapter5 核酸的分子操作5.1 限制性內切酶概念、分類、性質（做一般性的了解）限制性內切酶：一類能識別雙鏈DNA中短的特定堿基序列，并在序列內或旁側一定距離內特異切割雙鏈DNA的核酸水解酶。是體外剪切DNA的重要工具。分為I，II，III型同裂酶：兩種酶的識別核苷酸順序和切割位點都相同，它的區(qū)別只是在于，當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種可以切割，而另一種不能切割。同尾酶：兩種酶的識別序列不完全相同，但是切割后產生的粘性末端是相同的。限制性內切酶酶促反應的條件（需要注意）1DNA的純度2DNA的甲基化程度3酶切的反應溫度，一般為374DNA的分子結構5溶液中的離子強度核種類6緩沖

9、液的ph值星活性（star act）：當條件改變時，可能改變酶切識別序列的專一性，這種酶切特異性降低的現(xiàn)象稱為星活性或星號活性引起星活性的因素1. 甘油的濃度過高 >5%2. 酶過量 >100單位/ug3. 低離子強度 <25mM4. 高ph值 >8.05. 有機溶劑,如乙醇，乙二醇等6. 用其他陽離子代替Mg離子避免星活性的方法相應有：減少酶的用量，降低甘油濃度，提高離子強度，保證反正體系中沒有有機溶劑，降低ph值，用Mg離子做二價陽離子。5.2 操作和標記核酸的酶（了解）5.3 核酸分子雜交技術概念：具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對原則形成雙鏈的過

10、程。核酸分子雜交的基本原理: DNA變性和復性或雜交(hybridization)影響雜交的因素1核酸分子的濃度和長度：濃度大，復性快；分子量大，復性慢2溫度3離子強度4雜交液中的甲酰胺5核酸分子的復雜性6非特異性雜交反應 預雜交：封閉非特異性雜交位點，用鮭魚精子DNA分子雜交的基本方法1 Southern 印跡法：DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉印到固相支持物上，用探針進行檢測的方法。2 Northern 印跡法：檢測RNA（主要是mRNA）的方法3 斑點印跡雜交：將RNA或DNA變性后直接點樣于NC膜或尼龍膜上。優(yōu)點：簡單、快速、可同時檢測多個樣品4 原位雜交：將標記的核酸探針與細胞

11、或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。5 Western 印跡法：檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗血清對蛋白質進行鑒定及定量的方法6 液相雜交Chapter6 分子克隆本章應掌握作為受體細胞的大腸桿菌；由質粒衍生的載體；由噬菌體衍生的載體；粘粒載體；單鏈絲狀噬菌體M13載體；外源DNA與載體重組；重組DNA導入受體細胞；陽性重組體的篩選和鑒定。 本章涉及的主要概念基因克隆: 利用重組DNA技術分離目的基因克隆: 動詞：指從單一祖先產生同一的DNA分子群體或細胞群體的過程名詞：指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命

12、群體。基因文庫：由大量含有特定基因的不同DNA片段的克隆所構成的群體，分為基因組文庫和cDNA文庫基因文庫的構建：如果構建基因組文庫，首先提取基因組DNA，隨機打斷，打斷的方法有物理和生物方法，物理方法是超聲波粉碎（主要使用的方法），生物方法是酶切，然后用這些片段構建質粒，轉化并表達于大腸桿菌，得到大量的克隆。再將得到的序列進行測序，測序完成后就建成了基因文庫。對于文庫中的每一個克隆它的序列都是已知的。cDNA文庫的構建基本相似，先提取mRNA，然后反轉錄得到cDNA，打斷，裝入質粒，大量表達，最后測序。載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞（host cell）的工具稱為載體載體應具備以下特

13、點：1. 在宿主細胞內必須能夠自主復制（具備復制原點）；2. 必須具備合適的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制；3. 有一定的選擇標記，用于篩選；4. 有一定的拷貝數(shù)，便于制備。5. 附加因素：MSC，LacZ（-互補），ssDNA， phage，origin，Promoter以及cos位點等。載體的類型 質粒（plasmid）、噬菌體（phage）、粘粒載體（cosmid，又稱柯斯質粒）、噬菌粒（phagemid）第一節(jié) 質粒載體（Plasmid vectors）一、質粒的基本特性1概念: 染色體外的遺傳因子，能進行自我復制(但依賴于宿主編碼的酶和蛋白質）;大多數(shù)為雙鏈、閉合環(huán)

14、壯DNA分子，少數(shù)為線性;大小1kb20kb，也有更大的（200kb)2質粒的表型：抗抗菌素、抗重金屬、產生抗菌素、產生大腸桿菌素、產生溶血素、產生腸毒素、產生硫化氫、降解芳香族化合物、誘發(fā)植物腫瘤、糖發(fā)酵、產生限制酶和修飾酶3質粒的拷貝數(shù)：嚴緊型：拷貝數(shù)有限，大約1幾個；松弛型：拷貝數(shù)較多，幾十至幾百4質粒的不相容性：兩個質粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。在第二個質粒導入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質粒一般為利用同一復制系統(tǒng)，質粒分配到子細胞時會發(fā)生競爭，隨機挑選，微小差異，最終放大。5轉移性：在自然條件下，很多質?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。供體和受體細胞通過供體細胞

15、表面的纖毛接觸，然后一個質?？截愅ㄟ^該纖毛進入受體細胞F質粒：又叫F因子，即致育因子（fertility factor)的簡稱，為細菌的游離基因，在細菌的結合中使細菌能夠起雄性的作用。雄性細菌充當一個DNA供體并產生F性須，通過F性須DNA被轉移到受體的雌性細胞。二、標記基因 （做一般性了解）（1）氨芐青霉素抗性基因（AmpR ampr ampicillin）青霉素抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合，抑制轉肽反應并抑制其活性。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr tetracycline）與核糖體30S亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位（3）氯霉素抗性基因（chloramphenicol

16、, Cmr or Cat）Cm與核糖體50S亞基結合并抑制蛋白質合成。（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycinneomycin）可與核糖體成分相結合并抑制蛋白質合成的脫氧鏈霉胺氮基糖苷 -互補（complementation）p90. Lac Z基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。用做篩選標記MCS（Multiple cloning sites）多克隆位點：人工構建的，緊密排列的具有多種限制酶識別序列的一段DNA序列，可方便的用于外源DNA片段的插入。限制酶譜篩選1 轉化后挑取許多獨立的細菌菌落2 少量培養(yǎng)并提取質粒3 根

17、據克隆片段和插入載體的位點，選擇合適的限制酶進行酶切4 凝膠電泳分析限制酶圖譜，從而選出陽性克隆表達篩選1 構建表達載體（含高效啟動子）2 鑒定表達產物蛋白質的分子大小3 還可利用抗體進行篩選核酸探針篩選 根據核酸序列的同源性，利用核酸探針與轉化后宿主細胞中的質粒雜交，可篩選出重組的質粒。這種方法多用于大量篩選天然質粒用作克隆載體的局限性1分子量較大，不便于操作2拷貝數(shù)較低，不利于質粒DNA的制備3抗菌素抗性基因少，不便于選擇4單一的限制性酶切位點少，且不集中，不利于基因克隆質粒載體應具備的基本條件 設法將一些克隆中常見的有用性狀組裝進質粒載體，將天然質粒改造成理想的基因操作載體或適合于特定用

18、途的載體。1 具有復制起點2 具有抗菌素抗性基因3 具有若干限制酶單一識別位點，且在其中插入適當大小的外源DNA片段之后，應不影響質粒DNA的復制功能4 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)復制子（replicon）：能夠自我復制，而且僅具有一個復制起點的DNA分子三、質粒載體的種類（一般了解）pBR322是最早人工構建的質粒1. 克隆載體：用于擴增或保存DNA片段，為最簡單的載體。如pBR322 2. 表達載體基因的表達包括轉錄、翻譯與翻譯后加工、分離純化等過程根據被表達的基因和表達基因所用的系統(tǒng)，可將表達分為：1) 原核基因在原核細胞中表達2) 真核基因在原核細胞中表達3) 原核基因在真核細胞中

19、表達4) 真核基因在真核細胞中表達原核表達系統(tǒng)主要有：1) E.coli系統(tǒng)2) 枯草桿菌系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)主要有：1) 酵母細胞系統(tǒng)2) 哺乳動物細胞系統(tǒng)3) 昆蟲細胞（桿狀病毒）系統(tǒng)4) 高等植物系統(tǒng)克隆載體與表達載體的區(qū)別1 在原核克隆載體中通常都帶一個松馳型復制子、一個多克隆位點和一個篩選標記，以便被克隆和篩選的DNA序列能夠大量增殖。2 原核表達載體除了上述因子外，還需要有強啟動子、核糖體結合位點、轉錄起始信號、轉錄終止信號、翻譯起始密碼子和終止密碼子等一系列調控序列。 表達載體的選擇非常重要，選擇時主要應考慮下列因素：1. 所表達的蛋白質是融合蛋白還是天然蛋白。如果是天然蛋白，必須考

20、慮如何將目的基因準確地與載體銜接。如果是融合蛋白，則可以用三種不同閱讀框架的載體使目的基因與載體序列吻合。2. 被表達的基因是原核基因還是真核基因。原核基因一般都帶有核糖體結合位點，只需考慮它是否帶有強啟動子。對真核基因除考慮該基因是否帶有啟動子、核糖體結合位點外，還須考慮該基因是否會產生翻譯后加工，以后是否需要轉到真核表達系統(tǒng)中表達等。核糖體結合位點(ribosome-bindingsite)又稱SD序列(Shine-Dalgarno sequence)，它是指mRNA分子中能與核糖體結合的序列，通常位于翻譯起始密碼子前面312個堿基，該序列與16S rRNA的3端互補。3. 表達蛋白是否分

21、泌到體外。如需要分泌，則必須帶有信號肽序列，故應選擇帶適當信號肽序列的載體。信號肽(signal peptide)又稱前導肽(1eader peptide)，這是一種位于分泌蛋白質或輸出蛋白質N端上長約1530個氨基酸的序列，可被細胞的蛋白質加工機制所識別，使蛋白質通過細胞膜被分泌出來。4. 所產生的融合蛋白是否需要切割加工及如何切割加工。對需要切割的融合蛋白，在目的基因和載體序列間應有適當?shù)那懈钭R別序列。 5. 是否需要用強啟動子提高表達水平。當需要提高表達水平時，可選用強啟動子。但在某些情況下，由于被表達蛋白質對宿主有毒或其大量表達對宿主不利，可選用誘導型載體，只有經誘導后，蛋白質才能被表

22、達。表達融合蛋白的優(yōu)點以E.coli基因與外源目的蛋白基因組成融合基因產生的融合蛋白，可用作抗原產生抗體，然后用這種抗體測定或分離天然的目的蛋白。融合蛋白有下列優(yōu)點：1. 轉錄和翻譯起始從正常的E.coli序列開始，故通?？梢援a生高水平的融合蛋白。2. 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定。 3. 產生的融合蛋白較大，因此很容易從蛋白質凝膠電泳中區(qū)別出來。融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。4. 有些融合蛋白帶有信號肽，可以分泌到細胞外，這有助于蛋白質的分離和純化。真核基因的表達載體對表達真核基因，除了啟動子外，還需要有一個有效的核糖體結合位點。因為只有當被轉錄的m

23、RNA與核糖體結合后，mRNA才能被有效地翻譯。真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產生一個完整的蛋白質。因此需要用人工合成的轉接頭、人工合成的DNA引物或用DNA切割修補等方法使真核基因與載體的序列完全吻合。 分泌型表達載體有時為減少所需蛋白質在宿主體內被蛋白酶降解，或為使蛋白質能夠在體外正確折疊和便于提純，經常需要將被表達的蛋白質分泌到細胞外，因此要用分泌型載體。分泌型載體的優(yōu)點1一些在胞內被蛋白酶降解的蛋白質在周質中很穩(wěn)定。2一些在胞內無活性的蛋白質在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白質能夠正確折疊 。3產生的蛋白質沒有氨基末端甲硫氨酸，因為切割位點在信號肽與編碼序列之間，甲硫

24、氨酸會影響許多蛋白質的活性。分泌型載體的缺點1目的蛋白質的產量往往很低，2信號肽不能被切除或切在錯誤位置。提高原核細胞中外源基因表達效率的措施1以融合蛋白表達目的蛋白提高融合蛋白的穩(wěn)定性和產量。 2使用強啟動子提高mRNA產量，并在基因下游加入穩(wěn)定mRNA的強轉錄終止子，防止轉錄過度。3調整SD序列與ATG間的距離。SD序列與ATG的距離過長或過短都會影響目的基因的表達，有時由于這種距離的影響蛋白質合成會相差2,000倍以上。應該在目的基因ATG上游 100bp左右開始，用酶切形成不同長度的片段，與帶啟動子和SD序列的載體連接后，產生一系列重組DNA。從中選擇產生高水平天然目的蛋白的重組體。

25、4利用蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon營養(yǎng)缺陷型減少外源蛋白的降解。5在宿主內表達蛋白酶抑制產物，從而抑制蛋白酶活性。6使蛋白質分泌到體外，減少反饋抑制或蛋白酶降解。7調整帶目的基因的表達質粒的拷貝數(shù)，增加模板數(shù)。 8利用誘導物進行表達。過早地大量表達外源基因往往影響宿主細胞的繁殖，因此當不表達時，可使宿主細胞迅速繁殖生長得到較大的生物量，然后利用誘導物誘導目的基因表達。9人工合成目的基因，在不改變蛋白質氨基酸的前提下，根據簡并性，利用宿主偏愛的密碼子改變部分堿基序列。10定點誘變，消除核糖體結合位點附近可能的二級結構，這種二級結構會影響翻譯起始效率。外源DNA與載體重組粘性末端連接：連接效率

26、高若DNA插入片段與適當?shù)妮d體存在同源粘性末端，這將是最方便的克隆途徑。同源粘性末端包括相同內切酶產生的粘性末端和不同的內切酶產生的互補粘性末端。相同內切酶產生的粘末端連接得到的重組質粒能夠保留接合處的限制酶切位點，因此可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。而不同酶產生的粘性末端連接得到的重組質粒不能夠保留接合處的限制酶切位點，因此不可以使用原來酶將插入片段從重組體上完整地重新切割下來。以上兩類粘性末端的連接方法都很重要。另外，當用單酶切時，雖然產生了互補的粘性末端，但由于載體存在自連現(xiàn)象，也會降低正確插入的頻率。通過一些處理可以減少自連現(xiàn)象的發(fā)生。常用的方法是用小腸堿性磷酸酶

27、(CIP)去掉載體5¢-磷酸來達到抑制DNA片段的自身環(huán)化的目的。綜上所述，在進行基因重組時，一般采用插入片段及載體兩端具有兩個相應的能夠產生粘性末端的酶進行酶切后重組，如插入片段和載體的一端為EcoR I ，另一端為BamH I，它們都能產生粘性末端，不僅易于連接，而且又不能互補，所以能夠得到較好的重組結果。平端連接：連接效率低待插入片段的平末端主要由兩方面來源，即由酶切后產生的平端和補平后產生的平端。一般由酶切產生的平端較易連接。但在試驗過程中，往往會遇到插入片段和載體之間沒有互補的末端，這時，就需要將末端進行“補平”或去除3¢突出端，然后再用T4噬菌體DNA連接酶連接

28、兩個平端。不過，平端連接的效率是比較低的，一般通過提高DNA的濃度或增加連接酶的用量可提高平端的連接效率，有時也可采取在平端加上合成的接頭的方法，產生粘性末端，也可以提高連接的效率 。一端是粘性末端，另一端是平末端連接不需要去磷酸化。作連接用的基因片段要純化，量大一點，感受態(tài)做好一點。 只是通常連接時間會長一點（過夜好一點），用比較濃的酶。 重組DNA導入宿主 要注意的幾個名詞：轉化 轉導 轉染 感染 結合轉化（transformation）： 即一來自一個細菌細胞(供體)DNA(片段)被另一個細胞(受體)所吸收(隨后同受體染色體一起進行重組)感受態(tài)細胞（competent cell）：能夠吸

29、收DNA的細胞轉導 (transduction)：由噬菌體和細胞病毒介導的遺傳信息轉移過程或者說由噬菌體將細菌基因由一個細菌(供體)轉移到另一個細菌(受體)的過程。轉染 (transfection)：感受態(tài)細胞經分離出來的噬菌體核酸感染,隨后能產生出正常噬菌體后代或者說真核細胞主動攝取或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。感染 (infection)：病原微生物在寄主組織內立足的狀態(tài)目的基因的篩選和鑒定(screening/selection)1遺傳學方法插入滅活法(insertion inactivation):抗藥性標志選擇標志補救：表達產物與營養(yǎng)缺陷互補。包括- 互補、藍白斑篩選

30、 2免疫學方法3分子雜交探針-原位雜交4PCR5 限制性酶切圖譜 第七章 DNA序列測定與分析測序策略Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學直讀法雜交測序與DNA芯片技術ESTDNA序列分析DNA序列測定的幾個支撐技術Sanger雙脫氧末端終止法；PCR技術；DNA自動測序儀的發(fā)展；生物信息學分析軟硬件設施大規(guī)?；蚪M測序的兩種策略逐步克隆法（Clone by Clone）基因組DNABAC文庫根據物理圖譜正確定位的BAC 或contig用于霰彈法測序的候選克隆用于霰彈法測序的亞克隆測序并組裝完整的基因組序列全基因組霰彈法（Whole Genome Shot-gun)又叫鳥槍

31、法基因組DNA霰彈法克隆測序并進行全基因組序列組裝完整的基因組序列兩種大規(guī)模基因組測序策略的比較 項 目策 略全基因組霰彈法逐步克隆法遺傳背景不需要需要（需構建精確的物理圖）譜）速度快慢費用低高計算機性能高（以全基因組為單位進行）拼接）低（以BAC為單位進行拼接）適用范圍工作框架圖精細圖代表測序物種果蠅、擬南芥、水稻人、線蟲物理圖譜的構建 （不是重點）大規(guī)模表達序列標簽(EST)測定及分析p120.需要掌握：1、什么是EST?2、EST的應用 3、EST序列測定及分析過程ESTs（Expressed Sequence tags ）：是從已建好的cDNA庫中隨機取出一個克隆，從5末端或3末端對插

32、入的cDNA片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。EST的應用：1ESTs與基因識別ESTs已經被廣泛的應用于基因識別，因為ESTs的數(shù)目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人員更容易在EST庫中搜尋到新的基因(Boguski et al., 1994). 在同一物種中搜尋基因家族的新成員(paralogs)。 在不同物種間搜尋功能相同的基因(orthologs)。 已知基因的不同剪切模式的搜尋。2ESTs與基因圖譜的繪制 EST可以借助于序列標簽位點(sequence-tagged sites)用于基因圖譜的構建. STS本身是從人類基因組中隨機選擇出

33、來的長度在200-300bp左右的經PCR檢測的基因組中唯一的一段序列。來自mRNA的3非翻譯區(qū)的ESTs更適合做為STSs，用于基因圖譜的繪制。其優(yōu)點主要包括： 由于沒有內含子的存在，因此在cDNA及基因組模板中其PCR產物的大小相同； 與編碼區(qū)具有很強的保守性不同，3UTRs序列的保守性較差，因此很容易將單個基因與編碼序列關系非常緊密的相似基因家族成員分開。 （James Sikela等，1991年）3ESTs與基因預測 由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立時所采樣品特定發(fā)育時期和生理狀態(tài)下的一個基因的部分序列。使用合適的比對參數(shù)，大于90的已經注釋的基因都能在EST

34、庫中檢測到(Bailey et al., 1998)。ESTs可以做為其它基因預測算法的補充，因為它們對預測基因的交替剪切和3 非翻譯區(qū)很有效。4ESTs與SNPs來自不同個體的冗余的ESTs可用于發(fā)現(xiàn)基因組中轉錄區(qū)域存在的SNPs。最近的許多研究都證明對ESTs數(shù)據的分析可以發(fā)現(xiàn)基因相關的SNPs (Buetow et al., 1999;Garg et al., 1999; Marth et al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999) 。應注意區(qū)別真正的SNPs和由于測序錯誤( ESTs為單向測序得來，錯誤率可達2)而引起的本身不存在的SNPs。解決這

35、一問題可以通過： 提高ESTs分析的準確性。 對所發(fā)現(xiàn)的SNPs進行實驗驗證。5利用ESTs大規(guī)模分析基因表達水平 因為EST序列是從某以特定的組織的cDNA文庫中隨機測序而得到，所以可以用利用未經標準化和差減雜交的cDNA文庫EST分析特定組織的基因表達譜。標準化的cDNA文庫和經過差減雜交的cDNA文庫則不能反應基因表達的水平。ESTs數(shù)據的不足1ESTs很短，沒有給出完整的表達序列2低豐度表達基因不易獲得3由于只是一輪測序結果，出錯率達2%-5%4有時有載體序列和核外mRNA來源的cDNA污染或是基因組DNA的污染5有時出現(xiàn)鑲嵌克隆6序列的冗余，導致所需要處理的數(shù)據量很大Chapter

36、8聚合酶鏈式反應(PCR)本章應掌握的內容PCR的基本原理；PCR條件的優(yōu)化；由基本PCR拓展的相關技術及其應用 多聚酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的方法。PCR引物設計的重要性1 決定著擴增的特異性和擴增的效率。2 設計影響到后續(xù)載體構建的效率3 設計影響到實驗的成本引物設計原則：主要考慮長度，順序，堿基組成，二級結構，對3-端的要求，對5-端的要求， Tm值PCR引物的寡核苷酸數(shù)（長度）一般在1630個核苷酸（NT），至少為16個核苷酸，最好為2024個核苷酸 。（以上指與模板鏈完全配對的堿基數(shù)）太短

37、，特異性差；太長，自身折疊形成二級結構，Tm過高，不利于與模板穩(wěn)固配對，難以形成擴增起始二級結構。引物順序應是所要擴增基因特異的順序，若要進行個體間的比較，應選擇保守同一的順序來設計引物，設計后用電腦DNA數(shù)據庫檢測同源性。 引物的堿基組成GC為4060，ATGC最好隨機分布。GC太少擴增效果不佳，GC過多易出現(xiàn)非特異條帶，避免成串的嘌呤和嘧啶。引物中的二級結構一對引物的順序不應自身互補，特別要避免3-端的重疊，以免形成二聚體等特異的擴增條帶。對3-端的要求3-端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格配對。若3端最末的堿基不肯定，可用次黃嘌呤核苷取代的引物，因為 I 可與ATGC配對，這樣

38、可避免因末端堿基不配對而造成PCR失敗。防止3-末端發(fā)卡結構 、莖環(huán)結構 ！對5-端的要求5-端可附加一段與模板非互補的序列，可長至45NT，而不影響擴增，這點對研究基因結構與功能很有用。一般在引物的5-端可加入限制酶位點序列，以便進行克隆。在酶切位點5-端還應加上適當數(shù)量的保護堿基極（如GCGC和GGCC），以保證擴增反應產物克隆后能夠被酶切。設計5-端的RE位點序列是最費時的！功能基因起始密碼（ATG）5-端前應加入的序列（Kozak序列）。動物功能基因前加入序列：CCACCATG；植物功能基因前加入序列：AACAATG引物的Tm值（擴增特異基因，Tm一般選4060）1反應體系對引物退火溫

39、度的影響。如酶的最適工作溫度對引物退火溫度的限制等。太低，引物與模板非特異結合，出現(xiàn)非特異擴增條帶。太高，引物與模板結合不牢固，無擴增。2擴增產物的Tm值。引物和產物的Tm值不要相差太大，20范圍內較好。定下引物的Tm值范圍之后，即可定下引物的長度范圍PCR條件的優(yōu)化（常見問題分析與對策） 一、 假陰性：不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有:模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量及， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板： 模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸

40、變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。 酶失活： 需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物： 引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，

41、而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度： Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應體積的改變： 通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床

42、檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因： 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異： 如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 二、假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

43、 引物設計不合適： 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。 靶序列或擴增產物的交叉污染： 這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決： 操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與

44、引物互補后，可擴 增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變

45、性，65左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。Chapter 9 DNA分子標記技術 大綱要求基于Southern雜交技術的分子標記: RFLP，VNTRs基于PCR技術的分子標記: 隨機引物分子標記技術RAPD，AFLP，SSR/STR分子標記的應用領域 遺傳標記遺傳標記主要分為形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記和DNA 分子標記4 種類

46、型.理想的遺傳標記應具備多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、遺傳行為簡單、能檢測整個基因組、不受內外環(huán)境影響、操作經濟簡單等基本特征. DNA 分子標記： DNA 標記是DNA 水平上遺傳變異的直接反映,最能穩(wěn)定遺傳且信息量大,許多多態(tài)性標記在非編碼區(qū)表現(xiàn)選擇“中性”,不受內外環(huán)境影響,與基因表達與否無關,檢測迅速,操作也方便。由此可見,DNA 分子標記是最理想的遺傳標記。依多態(tài)性檢測手段可分為：以Southern 雜交技術為核心的分子標記和以PCR 技術為核心的分子標記限制性片段多態(tài)性( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP)這是第一個被應用于遺傳研究

47、的DNA 分子標記技術。 原理：限制性內切酶能識別并切割基因組DNA 分子中特定的位點,如果因堿基的突變、插入或缺失,或者染色體結構的變化而導致生物個體或種群間該酶切位點的消失或新的酶切位點的產生,用限制性內切酶消化基因組DNA 后,將產生長短、種類、數(shù)目不同的限制性片段,這些片段經電泳分離后,在聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)不同的帶狀分布,通過與克隆的DNA 探針進行Sourthern 雜交和放射自顯影后,即可產生和獲得反映生物個體或群體特異性的RFLP 圖譜。 探針的來源主要是cDNA 克隆,其中cDNA探針保守性較強,許多同科物種cDNA 探針都可以作為通用探針.RFLP 分析技術路線小分子DNA

48、 ,如細胞器基因,將純化的DNA 樣品用限制性內切酶消化成長度不等的片段進行瓊脂糖凝膠電泳分離,經溴化乙錠染色后在紫外光下直接觀察其多態(tài)性。大分子核DNA 需要借助分子雜交手段,用某一標記DNA 片段的探針與被轉移到硝酸纖維薄膜上的DNA 片段進行雜交,只有與探針有高度同源性的片段被檢測出來。RFLP 的優(yōu)點 ：呈孟德爾遺傳;不受環(huán)境影響,是一種共顯性標記, 結果穩(wěn)定可靠,重復性好。共顯性（codominance）：在雜合子狀態(tài)下，兩個基因的作用都表現(xiàn)出來。缺點RFLP 需要大量的DNA ,樣品要求高。多態(tài)性頻率較低。判讀有一定困難。實驗室之間結果比較有一定困難。制備放射性探針進行Southe

49、rn 雜交,因而比較費時,對人體健康有影響,對環(huán)境有污染 RFLP應用適用于構建表達圖譜。分析群體內和群體間遺傳變異度。群體間基因流評價和親緣關系時是強有利的評價。也可用于人類遺傳疾病的診斷。隨機擴增片段長度多態(tài)性標記(Random Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 1990 年由美國杜邦公司農產品研究中心的Williams 等用任意順序的10 個堿基的寡核苷酸片斷作為引物,用未知序列的基因組DNA 為模板,通過PCR 擴增獲得一組不連續(xù)的DNA 片段，經瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA 序列多態(tài)性.并將此法命名為RAPD。 RAPD 技術與PCR 技術相比較 1 R

50、APD 反應一般由1 個10寡核苷酸隨機引物,常規(guī)PCR 需用2 個20 bp 左右的特定設計引物; 2 RAPD 反應退火溫度低,一般是36 左右,一方面保證引物與模板DNA 的穩(wěn)定配對,同時允許適當錯誤配對,提高多態(tài)性檢出率; 3 常規(guī)PCR 為特異擴增,而RAPD 產物為隨機擴增. RAPD 技術路線 采用隨機序列10個核苷酸引物對基因組進行PCR 擴增,非特異引物可結合模板DNA 的多個位點,產生多個條帶,經電泳分離,或EB 染色,可直接檢測DNA多態(tài)性,并用于DNA 指紋分析. RAPD 的優(yōu)點 1引物設計是隨機的, 故可在對各種生物沒有任何分子生物學研究的情況下,對其進行DNA 多

51、態(tài)性分析。2所需模板DNA 的量極少, 只要有特定的DNA 片段, 就可將該DNA 片段擴增。3引物為人工合成, 通常一套引物可用于多物種的基因組DNA 多態(tài)性分析。4每個RA PD 標記就相當于一個靶序列位點(Sequence Tagged Sites) , 可以檢測出RFLP標記不能檢測的重復順序,可填補RFL P圖譜空缺, 更有效地進行遺傳圖譜的構建。5絕大多數(shù)RA PD標記遵從孟德爾遺傳規(guī)律。 RAPD 技術的局限性 1由于隨機引物較短,退火溫度低,因而對一些PCR 因素更敏感,重復性較差。一般來說,對于特定的儀器設備,對其反應條件反復進行優(yōu)化,才可以得到較可靠的結果。2分辨率低。3結

52、果不全是共顯性。4無法分析差異原因。應用1盡管RAPD 技術誕生的時間很短,但由于其獨到的快速、簡便的檢測DNA 多態(tài)性的方式,使這些技術已滲透于基因組研究的各個方面,在分子生物學的各個領域的研究中具有廣泛的應用前景。2適用于種質資源的鑒定和分類、目標性狀基因分子標記、遺傳圖譜的快速構建等研究,也可用于親緣關系等的研究擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism ,AFLP) 既有RFLP 的可靠性,又有RAPD 的方便性基本原理 在AFL P 中,如果DNA 片段遺傳特性發(fā)生改變,則酶切片段數(shù)目、長短發(fā)生變化,通過PCR 擴增基因組DNA

53、片段,擴增產物多態(tài)性就反映在變性聚丙烯酰胺電泳的圖譜上其中引物= 接頭+ 酶切位點+ 23 個核苷酸. AFLP 技術分析流程 1DNA 模板制備。2提取樣本DNA 經濃度和質量檢測后,一般采用雙酶切, 在基因組DNA 上產生低頻和高頻切口。3選擇性擴增酶切片段. 酶切后,限制性片段在T4 連接酶作用下與特定接頭連接,形成帶有接頭的特異性片段。4PCR 前擴增,一般用帶一個選擇性引物進行預擴增反應條件與常規(guī)PCR反應基本一致; 5利用放射性同位素標記或熒光標記PCR 引物。在Taq聚合酶作用下完成94變性30 s ,65淬火30 s ,72 延伸60 s ,PCR 擴增36 個循環(huán)。 6PCR

54、產物在含尿素聚丙烯酰胺上電泳。7將電泳后的凝膠轉移到吸附濾紙上,經干膠儀進行干膠處理。 8在X 光片上感光,數(shù)日后沖洗膠片并進行結果分析。優(yōu)點所需DNA 少(僅需0. 5 微克) ,也可以作用于線粒體DNA。從線粒體中得到RFL P研究所需的幾十到上百微克mDNA 是很困難的。Rosendahl 和Taylor 成功地從mycorrhizal 菌單孢子中獲得了AFL P 標記,而每個單孢子僅產生約0. 10. 5gDNA；效率高且簡單,RFLP 每次只能分析已知少數(shù)幾個位點,而AFL P呈典型的孟德爾式遺傳,每個AFL P 可以獲得50100 條譜帶信息,多態(tài)性強；分辨率高。AFL P擴增片段

55、短,片段多態(tài)性檢出率高,而RFL P 片段相對較大,內部多態(tài)性往往被掩蓋；可靠性好。AFL P 由于是特定引物擴增,退火溫度高 (一般65 ) ,只有那些與3端嚴格配對的片段才能得到擴增,選擇性很強.因而假陽性低,重復性好,克服了RAPD 缺點。Jones 等在歐洲8 個實驗室,使用共同的樣本,進行了嚴格的實驗,將得到的DNA 圖譜比較,172 條譜帶中僅一條出錯。這就是說,實驗室間的誤差要少于6 %；不需要Southern 雜交,不需要預先知道DNA 的序列信息。而且,已經發(fā)現(xiàn)在所有的多態(tài)AFLP 標記中, 共顯性的AFLP 標記出現(xiàn)頻率為4 %15 %,即200 個多態(tài)標記包括530 個基

56、因座位；李傳友等(2000) 將AFLP 標記和RFLP ,RAPD 標記進行比較,認為它們鑒別多態(tài)的功效是AFLP > RAPD > RFLP。 AFLP的應用 1在生物多樣性中將AFLP廣泛應用到那些無法通過形態(tài)特征區(qū)別的分子標記解決的家系或近緣物種與系統(tǒng)發(fā)生關系研究中,是生物多樣性調查的重要工具。2構建遺傳圖譜。3AFLP還可應用于基因定位和性別鑒定及繁殖行為研究中。AFLP的不足 1不是共顯性標記,擴增片段少數(shù)是共顯性條帶,多數(shù)是擴增片段有/ 無顯性條帶,條帶統(tǒng)計分析難度較大。2標記引物需要同位素或其它化學試劑,相對費時。3對操作人員的實驗技術水平要求較高。4對模板DNA的質量要