基因組序列比對分析及相關(guān)軟件的使用(精)

1、綜合性設(shè)計性實驗-5 生物基因組序列比對分析，分子進化 兔肝 DNA的提取與二苯胺顯色法測定 DNA含量 目的基因 SNP位點的鑒定及其意義 WWW.Ggene.Cn 此實驗共包括如下三個部分 1. 第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進化 2. 第二部分：兔肝DNA的提取和測定 3. 第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義WWW.Ggene.C n 第一部分：生物基因組序列比對分析、分子進化 全基因組序列數(shù)據(jù)的積累使得不同生物之間的進化關(guān)系可以從分子水平上進行研究。 不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學(xué)特征，這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列 使得我們可以研究從單細(xì)胞生物到檀物、動物甚至

2、人的進化關(guān)系。 比較基因組學(xué)(Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的 基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機理和物種進化的學(xué)科.利 用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病 基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu). 目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼 基因的比例較高，盍復(fù)順序和非編碼順序較少；其 GC%比較高：內(nèi)含子和外顯子 的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點在多種生物中一致。 WWW.Ggene.Cn 比較作圖就是利用共同的遺傳標(biāo)記(主要是分子

3、標(biāo)記、基因的 cDNA 克隆以及基因組 克隆)對相關(guān)物種進行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布情 況，提示染色體或染色體片段上的同線性( (synteny)或共線性(collinearity),從 而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進化歷程進行精確分析.基因組比較作圖的研究, 不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化 過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用。 比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特 點繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進化線索.廣泛的比較作圖可為多個種 所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。W

4、WW.Ggene.Cn 基因組比對軟件 Mauve VISTA Multi-SperioK (7oni|rativ0 Aim lysis in A I UM) Hi luuiuaM 75 5 一個最基本的假設(shè)是地球上所有物種都 有一個共同的祖先，從這個祖先開始以 數(shù)狀形式發(fā)展，通常稱為生命之樹 (tree of life) 分子進化研究的目的：通過序列同源性 的比較，分析序列間的變化進而了解基 因的進化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律 分子進化有兩個主要研究對彖，以全基 因組序列為研究對彖分析物種進化；以 某基因在多個物種的同源序列為研究對 象分析基因的進化 Protocolls WWW.Ggene

5、.Cn 0 qb|ACDO2429.il neutrophil gelaminese-essocitad lipocelin Ho. abl BA*8738 .丄1 lipoctlin Z (oncogene Z9p3) isofori CRA_a Ho. 7m Q E1NF 005555.2 L lipocalxn 2 (Moao sapiens sp IP9J188 I !4GA1M, le-113 0 qb| AAX36769 U lipoelxn 2 (synrhetic sonsruct Hl 1e113 0 qblAAV3e224.il liposalin 2 (orvsoacne

6、 2ip3) (synthetic constru. 41丄 2e-113 esnb ICAC4638 9. L I LCMZ (Hone stpier.s) 40? 6-113 b|C6A75T4.1| NGAL Hoac stpier.9) ) 40? 8e-113 Sequencer orcducirvg signifxcont aLignnentj： 系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì): 理論上，一個 DNA 序列在物種形成或基因復(fù)制 時，分裂成兩個子序列，因此系統(tǒng)發(fā)育樹一般 是二歧的； 如果是一棵有根樹，則樹根代表在進化歷史上 是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系 的分類單元.反映時間順序： 如果找

7、不到可以作為樹根的單元，則系統(tǒng)發(fā)生 樹是無根樹，反映距離; 從根節(jié)點出發(fā)到任何一個節(jié)點的路徑指明進化 時間或者進化距離。 WWW.Ggene.Cn 基因分子進化分析步驟 (1)以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列 DtetrlbiJUon of *10*1 Blast HKs on tne Query Sequence Mouse over to see the defline. click to show alignmGnts Color key for alignment scores K (Bxts) Vilue 根 WWW.Ggene.Cn ( (2)將上述同源基因的核酸

8、或蛋白序列作序列比對，Clustal X WWW.Ggene.C n (3)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA, PHYLIP, PAUP KOICHIRO TAMURA JOEL DUDLEY MASATOSHI NEI S U D H I R KUMAR ECDK IrqFBpEtDFT-VTNlLELl |Lir JqMVKiiFfqF ICKWOPJ ST： FI PrLLrEFAPP.rT K3WXEUQ1E| DVSLPl AL?- PPP.T8H. 8V ja3Vr.!YF.X ：WJ yYTZVQLr.SE HMFT AH F L Er rAP.ASL#E| PATLPaj L8L8FL

9、TAF ?FA :八 _ 口! iAQnr;rxi?c ：J|T* I C AAT學(xué)習(xí)從動物組織中提取 DNA 及其含最、純度測定的原理和方法 BACTERIA Crenarchaeota EUKARYA Nanoarch aeoti 掌握離心機及島津 UV.120 的使用方法 實驗原理 利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者分離，在 0.15M 的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在 0.15M 氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核 糖核酸蛋白解藹出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氮仿一異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉 淀除去，而 D

10、NA 則溶解。 實驗操作 注意事項 盡可能潞免 DNA 的斷裂 1. 勻漿時應(yīng)保持低溫，且勻漿時間應(yīng)短： 2. 實驗中使用的吸取 DNA 水濬液的滴管口應(yīng)粗短并成鈍口。 保持 DNA 活性，避免酸緘或其他變性因素使 DNA 變性. 攪動不要太大，以免使 DNA 斷裂。 整個實驗過程應(yīng)在低溫條件下進行。 攪拌時動作要輕，反復(fù)倒抽提，不可激烈振蕩。 加入 15% SDS 時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合） SDS 的溫度不能太低，易凝固。吸過 SDS 的吸管要及時清洗。 加入 CHCI/I/XA 液藹心后，分為三層，由上到下為：無機相蛋白相-有機相。DNA 溶解在無機相中，吸取無機相時動作要輕，不要吸

11、到蛋白相。 CHCI/IAA 會溶解有機玻璃，用完后不能豎直放賣在試管架上，必須沖洗干凈。 離心機的使用 打開電源開關(guān)； 平衡放賣藹心管；蓋上蓋子。 調(diào)節(jié)時間旋鈕至 iOmin； 緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至 9 檔，毎 5-10s 升 1 檔； 離心完畢后機器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。 離心管必須平衡后，才能啟動離心機： 離心機的蓋子必須蓋緊； 離心過程中不要用重物撞擊藹心機； 要等離心機完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子. 二苯胺顯色法測定DNA含量 實驗原理 DNA 的 a-脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成心輕基-r 銅基戊醛，與二苯胺共熱后 形成藍(lán)色化合物，該化合物在 595nm處最大吸收，

12、每 ml 含 20400 咋范圍內(nèi)光密度與 DNA 的濃度成：E 比。反應(yīng)液中加入少量乙 醛，可提高反應(yīng)的靈敏度。 實驗操作 取 8 支試管，按實驗指導(dǎo)的表格加入試劑. 加畢置沸水浴 10 分鐘，取出冷卻；以 0 號管（空白管調(diào)零點，于 595nm波長比色。 以光密度為縱坐標(biāo)，DNA 含量（pg/nil）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 將實驗中所得到的兔肝 DNA 溶液作為待測樣品， 取兩只試管， 分別標(biāo)“U”和“B”，按 表加入試劑。 混勻,置沸水中 lOmin.取出冷卻。 在 595nm處，以 B 管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于該光密度 值 DNA的含量。 核酸紫外吸收光譜

13、的測定 核酸在 220-320nm處呈特征性吸收，在 260nm處有最大吸收，測 A260/A280 可 得知核酸的大致純度. A260/A280 -1.8 表示 DNA 純 1.8 RNA 含量高 雙波長分光光度計.該種機采用兩個光源，可在可見光和篆外區(qū)對物質(zhì)進行 分析，鉤絲燈發(fā)出光的適宜范圍在 360-l(M)0nm,樂燈發(fā)出光的適宜范圍在 150-400nnu 通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內(nèi)使用。 使用石英杯作為比色杯。 島津 U V120 使用方法 打開電源，指示燈亮，調(diào)至 UV,打開樣品室蓋 打開訊燈（向下按至 Heat 幾秒后扳至 ON） 預(yù)熱 lOmin 調(diào)節(jié)漁長、靈敏

14、度 旋扭調(diào)至“（K100%T”，放入空白管與樣品，調(diào) U%T 蓋上蓋子，旋扭調(diào)至“ABS02J 調(diào) 0%A 拉出樣品，讀數(shù)。開蓋，記錄。 實驗操作 以 0.01N NaOH 為空白管，在 260nm和 280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣 品液的 A26O/A28O比值和 DNA 濃度。 第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義 SNP(single nucleotide polymophism)即單核昔酸多態(tài).是指群體中變異頻率大于 1 %的單個核昔酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，包括換、顛換、缺失和插入。 一般來說，一個 SNP 位點只有兩種等位基因，因比又叫雙等位基因。SNP 在人基

15、 因組中的發(fā)生頻率比較高，大約平均毎 1000 個堿基中就有一個多態(tài)位點。 WWW.Gge ne.Cn SNP對基因功能影響 根據(jù)在基因中的位 3L SNP 可分為基因編碼區(qū) SNP(coding SNRcSNP).基因內(nèi)含子區(qū) SNP 和基因調(diào)控區(qū) SNP(regulatory SNP, rSNP)o 其中 cSNP 根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又 可分為同義 cSNP (synonymous cSNP)和非同義cSNP(non-synonymous cSNP)o 非同義cSNP：,蛋白激酶RKCH基因內(nèi)的一個非同義 cSNP(1425G/A),等位位點從 G 到 A 的改變可導(dǎo)致激斷的活力增強

16、，進而激活其信號通路，使患腦梗塞的風(fēng)險增加。 同義 cSZP：多向性耐藥基因l(MDRl)第 3435 位的一個同義 SNP(3435C/T 河改變 基因產(chǎn)物的功能.這種機制不是通過改變 mRNA 及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變 mRN/的構(gòu)象、蛋白的折疊及細(xì)胞定位，進而影響基因功能的發(fā)揮。 內(nèi)含子區(qū) SNP：葡萄糖激酮調(diào)節(jié)蛋白(GCKR)基因第 16 號內(nèi)含子中的一個 SNP(rs780094, T/C),相比 C尊位位點，含 T 等位位點時，個體表現(xiàn)為葡萄糖水平較低、胰島素耐受較少, 患 2 型糖尿病的風(fēng)險較低。 調(diào)控區(qū)FSNP： IFN-Y基因啟動子區(qū)含一個 rSNP(-764G/C),

17、相比 C 等位位點， 含 G 等位位 點時,IFN-g基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合增強，啟動子活力提高到 23 倍。 WWW.Ggene.CnCC GG FTG AC TTG A C WWW.Ggene.Cn Hl 目的基因SNP的查詢 2 NCBI Natioiuil CenterBiotechnology- Information Matnnal brrarv of Medicine National Institires of Health Pub Med Ajj ba： abased BLAST OMIM Bocks TacBrovver Structure 卜hg /* r.eSi m

18、h xov/ Protrm: csquonca datbasa （；nnome: whol* genomo c quoncank $、P； 5m0l6 nudeotids DoOfnorEhisET Gene: gene-centered information XX MomoloGene: eukaryotic homoloov gtoupi GEN6AT: gene ewprejsion atlas of rrvouce central nervous syctem 3D Domaanc: domains from Ontro? Structuro UniSTS: markers and

19、mapping daU Pop* nt: population ttudy d*t* $t$ GEO Profiles: xprtssvon and mokcular abun GEO DataSets: expenmntal sets of GEO dHt Cancer Chromosomes: ctooenetjc database PubChem BioAssy: bioactivitf icreenj of ct PubChem Compound: urwQue ma!l molecule WWW.Ggene.Cn 2 NCBI Al Pub Med Nucleotide ENTREZ

20、 Protein Qrudufe SAich NCBI dbSNP BUILD 129 Entrez SNP searen SNP Search Mouse SNP Common Query Filters Entrez Batch Query SNP Unk Datamodel M/NCBI My NCBI help Enirez SNP Help Searchable FAQ Search Fields Programming Ublibes Batch Report Legend Examples y 伽 Limits Proview/lndox History | Clipboard

21、Click on the miAge below to xiexv tlie connections between Entie2T： | Gc J 0aar and otliei databases. 輸入基因名稱與物種 名稱 一如 NGAL.homo Type： Oriomi. MH| TA KielMl 亠 Y SI4P AC 山HI. Caietlcl Awocln！uu*NiMii 111 .hitce auciail MII * MHCKI to Mk l aUai le c Io F*ta e|&i*c *!* i t acwutKlQMdld2。 crTczucrrTA

22、 crreeATTaA AACICTCTAAA AeeAtieaAAe ecreAOTOCA cioeTOAOcrru R aooATe-Aaa Acaooe*reAC eec*TCAToaa TOACeATcrr cfTOEauz TOOAe/uaaac? BSeneView % NCBI PubMed Nucleotide Prolein Structure Senrch pNP 7 for鳳沁如0 y Y Y y i Limits Preview/I ndex History Clipboard Details Ncei dbSNP BUILD 120 Er rez CNP Search

23、 SNP Search Mouse SNP Common Query Fitters Ertrez Batch Query SNP Link Datamodel M/NCBI 謝NCBI help ErttGZ SNP Holp Searcnabie FAQ Search Fields Programming Utik Batch Report Legend Examples Display | Graphic Summary y Show 20 v Sort by * Send to y All: 31 Clinical/LSDB Submissions: 0 Human: 31 Mouse

24、: 0 敦 Items 1 - 20 of 31 GCGAACCCTCAGTCCAGCCTCAGGTC A/ G GGCATCCAGGACGGCCT CAGCCCTC 伽 5 irFKA Ho 3D HoCMM 2: 15528181 ffomo sapiens TAGGCAGAGCCAGTGAGGTCCCCGTT A/C GTCCCATTGAAAGCTCTAAAACCAG 3： Homo sapiens AGAACTTCATCCGCT TCT CCAAATCT C/T TGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGT WWW.Gge ne.Cn ence SNR(r*rswR) )CKis

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