植物基因克隆的方法

1、編輯課件1 基因 2. 基因克隆 3. 基因克隆的目標編輯課件2為RNA或蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列。利用體外重組技術(shù)，將特定基因 和其它DNA順序插入到載體中。識別、分離特異基因并獲得基因 的完整全序列，確定染色體位， 闡明基因的生化功能，明確其對 特定性狀的遺傳控制關(guān)系。 編輯課件3序列克隆2. 依據(jù)序列同源性克隆基因3. 人工合成并克隆基因4. 表型克隆 5. 功能克隆6. 定位克隆 7. 轉(zhuǎn)座子標記法編輯課件4根據(jù)已知基因的序列設(shè)計并合成一 對引物，從植物中提取DNA進行PCR擴 增，擴增的片段經(jīng)純化后連接到合適的 載體上，用酶切和序列分析檢測重子， 并與已知基因序列進行比較。編輯課件5

2、在其它種屬的的前提下，構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后以已知的基因序列作為探針來篩選目的克隆。例子：例子：根據(jù)甜菜堿醛脫氫酶基因序列克隆 菠菜堿醛脫氫酶基因、自交不親和 基因、花形態(tài)建成基因。 編輯課件6 從組織或細胞特異性的cDNA文庫中隨機挑選克隆5端或3端部分序列(EST,約400bp)測定GeneBank/EMBL檢索檢測所測序列或氨基酸序列與已知序列是否同源發(fā)現(xiàn)新基因編輯課件7利用利用Velculescu等建立的基因等建立的基因 表達表達 連續(xù)分析法連續(xù)分析法(SAGE). 此種方法只需檢測基因表達庫中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表達圖,根據(jù)基因表達圖就可以發(fā)現(xiàn)新基因

3、. cDNA測序法只能分離特定時空下表達的基因,且不能分析基因內(nèi)和基因間的調(diào)控序列,克隆出的新基因的功能也有待鑒定.編輯課件8根據(jù)已知的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏愛的密碼子，人工合成并克 隆該基因。（可對基因進行改造）根據(jù)蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合 成并克隆了此肽的基因。 人工合成Bt基因。 編輯課件9利用植物的表型差異或組織器官特異表達產(chǎn)生的差異來克隆植物基因。此方法試圖把表型與基因結(jié)構(gòu)或基因表達聯(lián)系起來，從而分離特定表型相關(guān)基因。不必事先知道基因的生化功能或圖譜定位，根據(jù)基因的表達效應(yīng)就直接分離該基因。利用表型差異從擬南芥中克隆出赤霉 素合成酶基因。編輯課件10差別篩選法（diff

4、erential screening）扣除雜交技術(shù)（subtractive hybridization）mRNA差異顯示技術(shù)（ mRNA differential display reverse transcription-PCR）代表性差異顯示（representational difference analysis）抑制性扣除雜交（suppression subtractive hybridization）編輯課件11 表型克隆技術(shù)普遍存在著依賴于PCR技術(shù)、重復性較差、加陽性率高、對實驗材料要求較高、材料間不能存在過多的差異，結(jié)果不便確證等缺點。編輯課件12根據(jù)性狀的基本生化特性這一功能

5、 信息，在鑒定和已知基因的功能后克隆.純化相應(yīng)的編碼蛋白 構(gòu)建cDNA 文庫或基因組文庫篩選基因。用基因表達的產(chǎn)物蛋白質(zhì)來克隆基 因. 編輯課件131、將純化的蛋白質(zhì)進行氨基酸測序，推測可能的mRNA序列,據(jù)此合成寡核苷酸探針從文庫中篩選編碼基因。2、將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)的抗體探針， 從文庫中篩選相應(yīng)基因并克隆。3、 根據(jù)mRNA序列設(shè)計相應(yīng)的寡核苷酸引 物,對核DNA或cDNA進行PCR擴增.編輯課件14首先應(yīng)根據(jù)已知的生化缺陷或特征確認與該功能有關(guān)的蛋白質(zhì)進行分離純化.要求分離一個純度很高的蛋白質(zhì).大多數(shù)基因產(chǎn)物至今還不清楚,即使知道了也不能純化足夠的蛋白質(zhì)供氨基酸測序或制備抗體.編輯

6、課件15 . 如擬南芥的cDNA文庫可與酵母的8個營養(yǎng)缺陷突變體互補.如來自蛋白激酶基因和葡萄糖載體基因等.編輯課件16例子例子1、分離純化了黃瓜花葉病毒、馬鈴薯x病毒 等，并克隆了編碼這些病毒外殼蛋白的 cDNA基因。2、構(gòu)建天麻cDNA文庫，制備抗體探針成功 地分離了編碼天麻抗真菌蛋白基因cDNA 克隆。編輯課件17根據(jù)遺傳連鎖分析，染色體步移將基 因定位到染色體的一個具體位置上后 不斷縮小篩選區(qū)域進而克隆該基因。連鎖分析：連鎖分析：通過基因與DNA標記之間的重組系數(shù)估計兩者之間的距離，若某種性狀的基因與DNA標記在子代不分離，即有連鎖在一起的趨勢。因此可將與某一DNA標記連鎖的基因在染色

7、體上定位。編輯課件18 用該法分離基因是根據(jù)功能基因在基因組中都具有相對穩(wěn)定的基因座，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的1個具體位置的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記，不斷縮小侯選區(qū)域，進而克隆該基因。編輯課件19RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等可將待測基因相對準確地定位，利等可將待測基因相對準確地定位，利用已知的基因可分離與之連鎖的未知因。用已知的基因可分離與之連鎖的未知因。構(gòu)建基因組文庫，用已知的A基因為探針，從文庫中篩選出與其有同源序列的a克隆，再以a克隆為探針從文庫中篩選出與其有同源序列的b克隆，依次類推最后篩

8、選出未知基因并把它分離出來。編輯課件201、篩選與目標基因連鎖的分子標記、篩選與目標基因連鎖的分子標記 利用目標基因的近等基因系或分離群體分組分析法（BSA）進行連鎖分析，篩選目標基因所在局部區(qū)域的分子標記。2、構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫、構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫。 用與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫，得到陽性克隆。：編輯課件213、構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克?。?、構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克?。╟ontig） 以陽性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫，并進行染色體步行，直到獲得具有目的基因兩側(cè)分子標記的大片段跨疊群。4、目的區(qū)域的精細作圖、目的區(qū)域的精細作圖 通過整合已

9、有的遺傳圖譜和尋找新的分子標記，提高目的基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的密度。編輯課件225、目的基因的精確定位和染色體登陸、目的基因的精確定位和染色體登陸 利用側(cè)翼分子標記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因。接著以目的基因兩側(cè)的分子標記為探針通過染色體登陸獲得含有目的基因的陽性克隆。6、外顯子的分離、鑒定、外顯子的分離、鑒定 陽性克隆中可能含有多個候選基因，用篩選cDNA文庫、外顯子捕捉和cDNA直選法等技術(shù)找到這些候選基因，再進行分離，時空表達特點，同源性比較等分析確定目的基因。編輯課件23不必知道基因產(chǎn)物的功能，也不需要知道產(chǎn)生某表型的生化、生理和病理過程。1、基因定位依賴分子標記。 2、構(gòu)

10、建跨疊克隆群困難。 3、精細作圖成本高。 4、不能提供基因的功能信息。編輯課件24例子例子 已在番茄、水稻、玉米、大豆、大麥、煙草等植物中發(fā)現(xiàn)了與抗病基因緊密連鎖的RFLP標記，并已克隆到相關(guān)抗病基因。如番茄Pto基因、水稻Xal21基因。編輯課件25是可以從一個基因位置轉(zhuǎn)移到另 一位置的DNA。是把轉(zhuǎn)座子作為基因定位 的標記和通過轉(zhuǎn)座子在染色體上 的插入和嵌合來克隆基因。編輯課件26 在轉(zhuǎn)座過程中，原來位置的轉(zhuǎn)座子并在轉(zhuǎn)座過程中，原來位置的轉(zhuǎn)座子并未消失，發(fā)生轉(zhuǎn)座的只是轉(zhuǎn)座子的拷貝。未消失，發(fā)生轉(zhuǎn)座的只是轉(zhuǎn)座子的拷貝?；虬l(fā)生轉(zhuǎn)座可引起插入突變，使插入位基因發(fā)生轉(zhuǎn)座可引起插入突變，使插入位置

11、的基因失活并誘導產(chǎn)生突變型或在插入置的基因失活并誘導產(chǎn)生突變型或在插入位置上出現(xiàn)新的編碼基因。通過轉(zhuǎn)座子上位置上出現(xiàn)新的編碼基因。通過轉(zhuǎn)座子上的標記基因（如抗藥性等）就可以檢測出的標記基因（如抗藥性等）就可以檢測出突變基因的位置和克隆出突變基因來。突變基因的位置和克隆出突變基因來。編輯課件27利用轉(zhuǎn)座子克隆植物基因的操作步驟：利用轉(zhuǎn)座子克隆植物基因的操作步驟：轉(zhuǎn)座子與選擇標記構(gòu)建成含有轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒載體利用Southern雜交等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)座子是否從載體質(zhì)粒中轉(zhuǎn)座到目標植物基因組中轉(zhuǎn)座子插入突變的鑒定及其分離。 編輯課件28 利用轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)對尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的植物進行基因克隆時，需要將異源的轉(zhuǎn)座子導入該植物，但由于轉(zhuǎn)座子在不同植物中轉(zhuǎn)座的頻率和活性相差很大，并且需要篩選大量的個體來鑒定轉(zhuǎn)座子