第八章抗體制藥本科教學

1、第八章第八章 抗體制藥抗體制藥抗體制藥第一節(jié) 概述第二節(jié) 單克隆抗體第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程第五節(jié) 抗體診斷試劑第六節(jié) 抗體治療藥物第一節(jié) 概述1890年：Behring和北里柴三郎等發(fā)現了白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。1937年：Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（）球蛋白、乙種（ ）球蛋白和丙種（ ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。20世紀60年代初期：抗原決定簇，精制單價血清。1975年：Khler和Milstein等，單克隆抗體，其具有高度特異性、均一性，以及來源穩(wěn)定可大量生產等特點。1984年：

2、人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結合試劑。單克隆抗體的應用用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標記 單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定。用于臨床治療，如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體制備導向藥物。但是要解決以下兩個問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。單克隆抗體的應用基因工程技術為解決這兩個問題提供了可能。已通過基因工程技術，制備出改形抗體、單

3、鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子質量只有完整抗體分子的1/801/3，而且鼠源性單克隆抗體的生物學活性如激活補體、促進吞噬功能（免疫調理）、抗體依賴細胞介導的細胞毒作用等，只保留同抗原特異性結合的活性。第二節(jié) 單克隆抗體單克隆抗體是將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而生產的。由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產生的，因此稱為單克隆抗體。它是結構和特異性完全相同的高純度抗體。制備的一般流程見下圖。單克隆抗體和單克隆抗體和多克隆抗體的多克隆抗體的制備制

4、備抗原脾B淋巴細胞融合融合淋巴細胞骨髓瘤細胞克隆1克隆2克隆3克隆4第二節(jié) 單克隆抗體一、抗原與動物免疫二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化一、抗原與動物免疫（1）制備用于動物免疫的適當抗原。 化學合成抗原，如精制的地高辛。多數情況下抗原物質只能得到部分純化，甚至是極不純的混合物，如部分純化的干擾素。通過克隆化選出最適當的單克隆抗體。在制備惡性腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體時，情況較復雜，需用整個腫瘤細胞做為免疫原，經過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細胞而不存在于正常細胞上的表面標志分子上的單克隆

5、抗體。一、抗原與動物免疫（2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得因免疫動物品系和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠，產生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫動物也多采用相應的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。選擇動物時應考慮到動物品系的免疫應答基因（Ir）對抗原免疫應答的影響。不同品系的小鼠與大鼠在對某類抗原的免疫應答上是不同的。書中表4-1是骨髓瘤細胞系一覽表，可以參考。一、抗原與動物免疫（3）免疫方法：體內免疫法和體外免疫法體內免疫法：適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用812周齡的雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌

6、、細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫，間隔13周，再追加免疫12次，可溶性抗原則按每只小鼠10100g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內，進行初次免疫，間隔24周，再用不加佐劑的原抗原追加免疫12次。一般在采集脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，其目的是使對應的B淋巴細胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因為細胞融合后增殖最好的細胞是迅速分裂的細胞。有人認為在常規(guī)免疫的基礎上用脾內免疫法做追加免疫較佳。一、抗原與動物免疫（3）免疫方法：體內免疫法和體外免疫法體外免疫法：用于不能采用體內免疫法的情況下，如制備人源性單克隆抗體，或者抗原的免

7、疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用。體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個g，免疫期短，僅45天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產生的雜交瘤細胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用48周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單個細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.55 g/ml，在5%CO2、37下培養(yǎng)45天，再分離脾臟細胞，進行細胞融合。二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（1）細胞融合基本方法：取適量脾細胞（1108）與骨髓瘤細胞（2 107 3107）進行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導它們融合，時間控制在2min以內，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（2）用于融合的骨

8、髓瘤細胞應具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。書中表4-1列舉了主要的骨髓瘤細胞系，其中SP2/0、P3.653細胞本身不分泌抗體，細胞融合后產生的雜交瘤細胞只分泌均一的、完全來自脾細胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細胞。特別是SP2/0細胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點，被國內外多個實驗室廣泛采用。二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（3）誘導劑PEG的影響：PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。但其粘度和對細胞的毒性也隨之增大。目前常用的PEG的濃度為40%50%，相對分子質量以4000為佳。但相對分子量4006000

9、，濃度在10%50%范圍之間的PEG都能使細胞融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亞砜(DMSO），以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都對細胞有毒性，必須嚴格限制它們和細胞的接觸時間，可通過低速離心5min使細胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細胞。二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細胞和瘤細胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細胞和瘤細胞在這樣的條件下，幾天內亦迅速死亡。

10、由于SP2/0等骨髓瘤細胞都是次黃嘌呤（H）鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT）缺乏株，脾細胞中卻有這種酶，因此脾-瘤融合的雜交瘤細胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使雜交瘤細胞得以生長二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表4-2），加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔板內，根據情況每23天換液一次。換液時吸去1/22/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合后7天內用HAT培養(yǎng)液，殺死瘤-瘤融合細胞后，第714天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表4-3），從融合后8

11、9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測，篩選出產生抗體的陽性克隆。二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（6）飼養(yǎng)細胞：由于在最適的條件下大約有105個脾細胞才能形成一個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個或少數的雜交瘤細胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞和胸腺細胞等。一般認為飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還能清除死亡細胞，故應用的較多。三、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克?。阂驗楫a生特定抗原的抗體產生細胞只占所有脾細胞的5%左右，所以要進行每孔培養(yǎng)上清的

12、抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進行克隆化培養(yǎng)。為了盡快地篩選出陽性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡便并一次能檢測大批標本的方法。常用的檢測方法有免疫酶技術、免疫熒光技術和放射免疫技術等。一般來說，免疫酶技術和放射免疫技術均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫熒光技術適用于細胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標本為目的的抗體時，免疫熒光法更有意義，在篩選抗體的同時，還能對所識別的抗原進行定位判定。1、精制破傷風毒素抗原（ ）吸附（約10g/ml，4，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ）（4，1h）3、加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（ ） （4，1h）洗

13、滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風抗體的篩選三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來的陽性克隆中，可能含有不分泌抗體的細胞或有多株分泌抗體的細胞 ，而且剛剛融合獲得的雜交瘤細胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應盡早克隆化。一般融合后獲得的 雜交瘤細胞要經過大約3次的克隆化，才能達到100%孔內均為抗體陽性細胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法是把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個細胞難以

14、存活，克隆化時也需加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長。三、篩選陽性克隆與克隆化（2）克隆化有限稀釋法和軟瓊脂法軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊打碎后，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。用這種方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功。四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定（1）雜交瘤細胞的鑒定正常鼠的脾細胞染色體數為40，全部是端著絲粒染色體。小鼠骨髓瘤細胞的染色體數變異較大，SP2/0細胞為6268，NS-1細胞為5464，大多數為非整倍性，并且有中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色

15、體。雜交瘤細胞的染色體在數目上接近兩種親本細胞染色體數目的總和，在結構上除多數為端著絲粒染色體外，還應出現少數標志染色體。染色體數目較多又比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體，而染色體數目少且比較分散的雜交瘤細胞分泌抗體的能力較低。四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定（2）抗體性狀的鑒定由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學特性差異較大，諸如補體活化、免疫調理、ADCC效應等等，因此要對制備的雜交瘤細胞產生的單克隆抗體，進行Ig類和亞類的鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體，進行免疫擴散或ELISA法來鑒定。在單克隆抗體鑒定中還必須進行親和力測定，它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據

16、。另外根據需要不同，還應對單克隆抗體的特異性、純度和識別抗原的相對分子量等進行測定。五、單克隆抗體的大量制備（1）體外培養(yǎng)法可獲得10g/ml的抗體；（2）動物體內誘生法，可獲得520mg/ml的抗體。目前多采用后者生產制備單克隆抗體。因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自BALB/c小鼠，所以應選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。為了使雜交瘤細胞在腹腔內增殖良好，可于注入細胞的幾周前，預先將具有刺激性的 有機溶劑降植烷（pristane）注入腹腔內，以破壞腹腔內膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。動物體內誘生法操作簡便，也比較經濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污

17、染雜菌的雜交瘤細胞株，缺點是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。五、單克隆抗體的大量制備書中介紹了體外培養(yǎng)法和動物體內誘生法的具體步驟以及其它一些近來發(fā)展的方法。這里不一一介紹。利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細胞生長空間，雜交瘤細胞生長旺盛，單克隆抗體產量得到提高。連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細胞密度可達2.0107細胞/ml，收集的單克隆抗體可達到400g/ml左右。如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細胞生長的載體，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細胞生長，細胞密度可達108細胞/ml。并能收獲更多的單抗。此稱為微載體懸浮培養(yǎng)法，固體顆粒用 DEAE-Sephadex A 50等材料制成。六、單克隆抗體

18、的純化動物體內誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程1、澄清和沉淀處理小鼠腹水中含有紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質等，應首先用離心力1000g離心5min，去除殘留的小顆粒物質；再用0.2m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細菌、支原體和脂質；用飽和硫酸銨沉淀抗體，50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2、分離根據用途可選用不同的方法，主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。六、單克隆抗體的純化2、分離（1）凝膠過濾 用于IgG和IgM類單克隆抗體的分離純化。常用Sephadex G200作分離介質，可收集到三個峰，最高峰為IgM，另兩個峰為IgG，抗體回收率達50%80%，能去

19、除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。（2）陰離子交換層析 用于IgG類單克隆抗體的分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強度條件下洗脫下來，其純度較高。IgG2b、IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產量，但其純度相對較低。在pH5.5條件下，把雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時，所有的抗體都能結合到柱上，而55%的雜蛋白可被洗脫掉，再用不同離子強度的洗脫劑洗下。續(xù)（2）離子交換法在最適離子強度及pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化25100倍。高容量、高流速、化學穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克

20、隆抗體的大規(guī)模純化。（3）親和層析多用蛋白A親和層析，適用于IgG類單克隆抗體的純化。IgG與蛋白A的結合與pH有密切關系，鼠源性單克隆抗體在pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體 的改進改造鼠源性單克隆抗體的目的：一是降低免疫原性；二是降低相對分子量，增加組織通透性。如將鼠源性單克隆抗體的C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換，則對人的免疫原性消失。對鼠

21、源性抗體的改造已有很多成果報道，見書中表4-4，給出了改造后的單抗的類型和特性：有人-鼠嵌合抗體（人IgC-小鼠IgV，150000）、改形抗體（將小鼠CDRs替換為人CDRs，150000）、Fab(完整L鏈和Fd，50000）、FV（VH和VL，25000）、單鏈抗體（SCFV，VH-多肽-VL，27000）、單域抗體（ VH或VL，12500）、最小識別單位（MRU）（一個CDR，2000）。一、人-鼠嵌合抗體制備方法：提取雜交瘤細胞系的mRNA，經過逆轉錄成cDNA，并以其為模板，采用特異引物，用PCR方法分別擴增VL和VH基因，再分別連接真核表達所需的上游啟動子、前導肽序列和下游剪切

22、供體信號、增強子真核調控序列后，將VL基因克隆到人Ig的CL基因表達載體上，將VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表達載體上，再將人-鼠嵌合的V-C區(qū)基因質粒DNA等量混合，在脂質體介導下共轉染骨髓瘤細胞SP2/0，轉染后用含霉酚酸進行篩選，形成集落的細胞即為共轉染細胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結合的特異性，但對人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替換鼠IgG1或IgG2b，則可有效地加強多肽的ADCC效應與免疫調理作用。二、改形抗體Ig分子中參與構成抗原結合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補性決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。 H和L鏈各有

23、三個CDR，其他部分稱為框架區(qū)。如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結合特異性?？贵w分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。這種改形抗體（reshaping antibody）又稱CDR移植抗體（CDR grafting antibody）。書中表4-5給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應用。三、小分子抗體基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子量僅為原抗體的1/801/3。也就是說，保留了CDR區(qū)，而Ig分子的C區(qū)不表達?，F在研制的小分子抗體有以下幾種類型：（1）Fab抗體，由完整的輕鏈和重鏈（

24、VH和CH1） 所組成。（2）FV抗體，由VH和VL組成，天然FV片段中VH和VL為非共價性結合。（3）單鏈抗體（single chain antibody SCA 或single chain FV,SCFV），由VH和VL通過一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白。有分子量小、穿透力強、免疫原性小特點，可與效應分子相連接構建新功能抗體分子，是構建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。（4）單域抗體，由VH(VL)單個可變區(qū)組成的，只有抗體分子的1/12，而且表面疏水性強，與抗原非特異結合能力也強。（5）最小識別單位（MRU）是由單個CDR區(qū)構成的小分子抗體，親和力較低。四、雙功能抗體雙功能抗

25、體就是雙特異性抗體（biospecific antibody, BsAb）。它是一種非天然性的抗體，其結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。1、化學交聯(lián)法2、生物學方法（雜種-雜交瘤）雜交瘤細胞與脾細胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的 雜種-雜交瘤細胞。3、基因工程方法 采用適當的接頭連接不同抗體的VH和VL區(qū)，使它們不能形成鏈內的分子內配對，讓其形成原抗體的分子內配對，構建雙特異性（ SCFV)2。五、抗體融合蛋白類型有： （1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（40受體-FV型融合蛋白。

26、（5）酶-抗體型融合蛋白。其中較為成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗體型融合蛋白（即抗體酶，abeneyme）在藥物治療中應用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導的酶前體藥物治療。五、抗體融合蛋白構建抗體融合蛋白的原則是：將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，即可實現兩個基因共表達。在抗體的N端和C端融合其它蛋白都可以獲得成功。關鍵是兩個蛋白間的接頭序列l(wèi)inker，一般說來35個氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。第四節(jié) 基因工程

27、抗體和抗體工程一、噬菌體抗體庫技術的基本方法1、獲得目的基因2、抗體庫技術的載體：現在普遍使用噬菌粒（phagemid）載體，其中的pHEN1為新一代載體，轉化效率高，有利于提高庫容量。3、淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復與抗原吸附，經幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴增。四、表達與鑒定：目的克隆經過鑒定后，再導入感受態(tài)菌株，進行可溶性表達，其產物用western blot分析確定后，就完成了全過程。二、噬菌體抗體庫技術的特點1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫1011庫容，能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。VH和VL隨機重組增加抗體的多樣性。2、避