代謝工程——PHA

1、聚羥基脂肪酸的代謝工程機理和應用研究 曹 文 斌 盧 加 貴 黃 蘭 李 元 秀 霍 虹 宇 張 家 銘G P 3 目 錄背景與前言PHA的生物合成困難與解決背景與前言 多聚羥基烷酸（PHAs）以治理白色污染為契機，因其有著與石化塑料相似的理化性質，又能在一定條件下被微生物迅速而徹底地降解，成為一種理想的傳統(tǒng)石化塑料替代品。此外，PHA具有良好的生物相容性、降解產(chǎn)物無毒性及表面可修飾性等性質，這便極大地拓展了它的應用范圍，使其在醫(yī)療與醫(yī)學組織工程方面也有廣闊的應用前景。PHA成為科學家們研究的熱點。背景與前言關于PHA： 一種高分子聚酯，在微生物細胞，特別是細菌細胞中，在碳源過量而其他營養(yǎng)不足

2、時，作為能源儲備物質存在著。 PHA家族中單聚物、共聚物及共混物種類的眾多。 具有：1）生物降解性 2）可再生性 3）生物相容性 4）代謝產(chǎn)物無毒性 5）表面可修飾性背景與前言聚合物命名：1）R為甲基時，其聚合物為聚-羥基丁酸(PHB)2）R為乙基時，其聚合物為聚-羥基戊酸(PHV) 3）在一定條件下兩種或兩種以上的單體還能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV組成的共聚物P(3HB-co-3HV)。PHAs的物理化學性質：1）PHB較脆和發(fā)硬，但可通過與適量HV共聚而補償2）隨著PHBV中HV組分的增加，聚合物的勁度降低而韌性增加，且熔點亦降低，使得較易對其進行熱加工處理。3）單體4HB的聚

3、合物或3HB與4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)則是高彈體，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。PHA的生物合成Pathway I(a)這是一種由-酮硫解酶(phaA編碼)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(phaB編碼)催化合成3-羥基丁酰輔酶A?？删唧w為三步反應-酮硫裂解酶催化乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA在依賴NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶的作用下把乙酰乙酰CoA還原成(R)-3-羥基丁酰CoA 單體(R)-3-羥基丁酚CoA由PHA合成酶催化聚合成PHAPHAPathway I(b)糖代謝或其他代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A-酮硫裂解酶催化兩個乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA在依賴NADPH的乙酰

4、乙酰CoA還原酶的作用下把乙酰乙酰CoA還原成(R)-3-羥基丁酰CoA 單體(R)-3-羥基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA依賴NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶催化(L)-3羥基丁酸CoAB(L)-3羥基丁酸CoA經(jīng)過兩個立體專一的烯酰輔酶A水合酶先后作用而轉變成(R)-3羥基丁酸輔酶AAPathway IIPHAPHAs的合成與脂肪酸氧化途徑的中間產(chǎn)物相連。使用其中間產(chǎn)物為碳源來合成PHA脂肪酸氧化生成?；鵆oA?；鵆oA轉化成烯?；鵆oA烯?；鵆oA在PhaJ（(R)-烯酰基CoA水合酶）催化下生成(R)-3-羥基丁酰CoA單體(R)-3-羥基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成P

5、HAPathway IIIPHA這是一條以脂肪酸合成途徑的中間產(chǎn)物為底物進行PHAs的合成路徑由糖代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物為起始，轉化至丙二?；鵄CP丙二?；鵄CP進入脂肪酸合成反應中，生成中間產(chǎn)物3-酰乙基ACP3-酰乙基ACP生成(R)-3-羥基丁酰CoA 單體(R)-3-羥基丁酰CoA由PHA合成酶催化聚合成PHA困 難難獲取高純度的合成酶難獲取羥基脂肪酸輔酶A生產(chǎn)成本偏高改進策略 I難獲取羥基脂肪酸輔酶ASOLVE（R)-3-羥基?；d體蛋白-輔酶A轉?；福≒haG）基因克隆原 因1.目前前體供應是合成過程中的瓶頸。2.提供中長鏈3-羥基脂肪酸單體的酶使用PhaG更經(jīng)濟操 作應用PCR法克

6、隆該基因，并選擇pBBRIMCS-2作為起始質粒，構建表達載體H13分別通過PCR法將PhaC1基因和PhaC基因分別插入表達載體，構成C08和C09表達載體表達功能的驗證以及穩(wěn)定性驗證新克隆DNA片段的功能驗證以及對受體生長的影響重組質粒導入E.coli，在不同碳源條件下利用PhaG合成羥基脂肪酸的情況與結果改進策略 I難獲取羥基脂肪酸輔酶ASOLVE1）根據(jù)DNA片段的同源性，分離獲得的PhaG基因在重組質粒上，證實為有遺傳效應且有表達能力的片段。小 結2）異源表達新克隆得到的phaG基因同源DNA片段對菌株的生長沒明顯影響，且顯著提高了菌體中中長鏈PHA的積累量。3）利用質粒pLZZGP

7、p在E. coli HB 101中異源表達PhaG（來自P.pudita）可以促使該重組菌株利用葡萄糖、果糖等碳水化合物直接生成中長鏈3一羥基脂肪酸單體。4）接種于最適培養(yǎng)基（含有5 g/L果糖、100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)9小時時加入1 mM IPTG, 12小時時補加30g/L果糖，24小時時加入0. I mg/L三氯生)上的E. coli 經(jīng)48小時的培養(yǎng)可以在胞外積累高達722 mglL的3-羥基癸酸改進策略 IISOLVE難獲取高純度的合成酶還未有文獻報道關于獲取高純度的合成酶來完成體外操作。工業(yè)化的主要操作還是借助微生物發(fā)酵工程的生產(chǎn)。近似的有關于應用基因工程技術，篩選基因，重組細胞生產(chǎn)。但是由于實驗多于合成和降解研究，基因調控方面能容甚少，所以以上假象仍只能處于實驗室階段。研究方向使短鏈和長鏈共聚，增強材料的性能降低生產(chǎn)成本，增加生產(chǎn)效率效果不理想有將PhaC移到植物質體中，并成功生產(chǎn)改進策略 III生產(chǎn)成本偏高SOLVEPHAs實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要障礙是生產(chǎn)成本。影響PHAs生產(chǎn)成本的主要因素有：(1)原料(2)操作方式(3)提取方法(1)采用廉價基質(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡