紅霉素生產(chǎn)工藝

1、畢業(yè)論文畢 業(yè) 論 文題 目： 淺談紅霉素發(fā)酵工藝 系 部： 生物工程系 專 業(yè)： 生物技術(shù)及應(yīng)用 班 級(jí)： 姓 名： 學(xué) 號(hào)： 指導(dǎo)教師： 2012 年 4 月 10 日目 錄摘 要··································

2、3;·································51 前 言···············

3、3;·················································61.1

4、簡(jiǎn)述·················································61.2

5、物化性狀·················································61

6、.3作用機(jī)理·················································

7、61.4 紅霉素發(fā)酵的研究意義·············································· 61.5紅霉素研

8、究現(xiàn)狀·················································71.

9、6現(xiàn)階段的研究方向················································

10、83;72紅霉素發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)········································72.1發(fā)酵工藝流程·····&

11、#183;···········································72.1.1一級(jí)發(fā)酵工藝····&

12、#183;············································72.1.2二級(jí)發(fā)酵工藝···&

13、#183;·············································82.1.3三級(jí)發(fā)酵工藝··&

14、#183;··············································82.2紅霉素發(fā)酵操作要點(diǎn)·

15、················································92.2.1紅霉素發(fā)酵營(yíng)

16、養(yǎng)組分·················································92.

17、2.1.1碳源營(yíng)養(yǎng)················································

18、83;92.2.1.2氮源營(yíng)養(yǎng)···············································

19、83;·102.2.2紅霉素發(fā)酵操作注意事項(xiàng)········································112.2.2.1紅霉素發(fā)酵PH控制··

20、83;·············································112.2.2.2紅霉素發(fā)酵豆油的控制·&#

21、183;·····································112.2.2.3紅霉素發(fā)酵溫度的控制·········&

22、#183;·····························122.2.2.4紅霉素發(fā)酵溶氧的控制·················

23、······················122.2.2.5紅霉素發(fā)酵空氣的控制·························

24、;··············122.2.2.6發(fā)酵液質(zhì)量控制·································&

25、#183;··············132.2.3有效成分測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)································

26、3;···············133結(jié) 論·································

27、3;······························13參考文獻(xiàn)··················

28、3;············································14謝 辭·····

29、;··················································

30、;···········15摘 要紅霉素是20世紀(jì)50 年代開(kāi)始生產(chǎn)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，他的抗菌譜與青霉素G相似，只要用于抗革蘭氏陽(yáng)性菌所致的感染，對(duì)青霉素耐藥菌和某些病原體如軍團(tuán)菌、螺桿菌、支原體、衣原體、放線菌、非結(jié)核分枝桿菌、立克次體及某些厭氧菌感染有效。紅霉素還具有改善機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，對(duì)不斷增加的許多致病微生物也有良好的抗菌活性。隨著對(duì)紅霉素的研究開(kāi)發(fā)深入開(kāi)展，一些高效、長(zhǎng)效、生物利用度好、各具特色的新紅霉素半合成衍生物具有很大的市場(chǎng)潛力。本次研究對(duì)紅霉素的發(fā)酵條件進(jìn)行了簡(jiǎn)

31、要的探討，其中紅霉素的發(fā)酵單位達(dá)XXX，相當(dāng)于目前國(guó)內(nèi)紅霉素的生產(chǎn)有了一定的突破和進(jìn)展，對(duì)紅霉素的工藝研究具有一定了理論指導(dǎo)意義及重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。關(guān)鍵字：紅霉素；發(fā)酵工藝參數(shù)；探討山東職業(yè)學(xué)院 1前 言1.1簡(jiǎn)述紅霉素是由紅霉素鏈霉菌（Streptomyces erythreus）所產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯（macrolide）系的代表性的抗菌素?？梢砸种萍?xì)菌蛋白質(zhì)的合成，系抑菌劑，其中主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、立克次氏體等具有抗菌活性，是治療耐藥性金黃色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引起疾病的首選藥物。隨著紅霉素衍生物藥物的不斷涌現(xiàn)，對(duì)紅霉素的認(rèn)識(shí)提升到了新的層面，如何提高紅霉素發(fā)酵單位成為近來(lái)研究開(kāi)發(fā)的

32、熱點(diǎn)。現(xiàn)階段，我國(guó)紅霉素年產(chǎn)量與國(guó)際水平相差較大美國(guó)亞培公司年產(chǎn)量達(dá)2000t，我國(guó)僅200t（馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息,203:15.），國(guó)外的發(fā)酵單位也高達(dá)8000-12000u/ml(馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息,203:15.)。1.2物化性狀紅霉素分子式 C37H67NO13，分子量 733.93 ，熔點(diǎn) 138-140，為白色或類白色的結(jié)晶或粉末；無(wú)臭，味苦；微有引濕性，易溶于乙醇和丙酮，微溶于水，是-種堿性抗生素。是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要活性成分是紅霉素A，雜質(zhì)組分主要有紅霉素B、紅霉素C、紅霉素D、紅霉素E以及紅霉素F等。其中主要雜質(zhì)為紅霉素C。1.3作用機(jī)理主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌

33、具有抗菌性。LD50為200400毫克/公斤，與細(xì)菌的聚核糖體結(jié)合而抑制肽鏈的延伸，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。1.4 紅霉素發(fā)酵的研究意義 紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣譜抗菌作用，其抗菌譜與青霉素相似，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌尤其敏感。臨床主要用于扁桃體炎、猩紅熱、白喉、淋病腸道阿米巴病、皮膚軟組織感染等的治療。上、下呼吸道感染也可選用紅霉素。需要特別指出的是，紅霉素對(duì)于不能耐受青霉素的患者也適用。紅霉素除被收入中國(guó)藥典外，還被收入美國(guó)、英國(guó)、日本等許多國(guó)家的藥典中。近年來(lái)，在競(jìng)爭(zhēng)激烈的抗生素市場(chǎng)上，紅霉素及其衍生物產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，銷售額不斷上升，預(yù)計(jì)今后的市場(chǎng)仍有廣闊的發(fā)展空間。1.5紅霉素研究現(xiàn)狀

34、現(xiàn)階段，我國(guó)紅霉素年產(chǎn)量與國(guó)際水平相差較大美國(guó)亞培公司年產(chǎn)量達(dá)2000t，我國(guó)僅200t（馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息,203:15.），國(guó)外的發(fā)酵單位也高達(dá)8000-12000u/ml(馬培齊.醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息,203:15.)。1.6現(xiàn)階段的研究方向通過(guò)控制優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵過(guò)程中溶氧、PH、空氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、補(bǔ)料等來(lái)提高紅霉素A的含量，從而提高紅霉素的產(chǎn)量。2紅霉素發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)2.1發(fā)酵工藝流程2.1.1一級(jí)發(fā)酵工藝一級(jí)培養(yǎng)基配方：打入軟化水200L、豆餅粉8.75kg、玉米淀粉10.76kg、糊精9.30kg、玉米漿4.65kg、鹽2.43kg、硫酸銨1.23kg、豆油4.25kg、

35、消泡劑0.16kg，用液堿調(diào)PH至6.2（±0.1），加入CaCO3 3.45kg，再打軟化水至400L。初始條件：溫度34.0 灌壓0.05Mpa 轉(zhuǎn)速 80rpm 通氣量0.8vvm 溶氧100當(dāng)溶氧低于40時(shí)，采用轉(zhuǎn)速和空氣流量交替上升的方式來(lái)提高溶氧，轉(zhuǎn)速每次提高10轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量801200.91201601.01602001.12002401.21.5移種標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)PH先上升（第一個(gè)高峰），再下降，再上升后當(dāng)?shù)谌齻€(gè)高峰出現(xiàn)后（第四個(gè)高峰），向后推46小時(shí)開(kāi)始移種，需要推遲移種時(shí)間時(shí)，溫度可以降至32降速為0.5h。2.1.2二級(jí)發(fā)酵工藝初始條件

36、：溫度33.0 灌壓0.05Mpa 轉(zhuǎn)速 70rpm 通氣量 1.0vvm 溶氧100當(dāng)溶氧低于40時(shí)，采用轉(zhuǎn)速和空氣流量交替上升的方式來(lái)提高溶氧，轉(zhuǎn)速每次提高5轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量70851.15851051.21051201.351201351.41.55移種條件：移種發(fā)酵罐時(shí)，條件是當(dāng)PH先上升（第一個(gè)高峰），在下降，在上升后當(dāng)高峰出現(xiàn)后（第二個(gè)高峰），向后推46小時(shí)開(kāi)始移種，或第一個(gè)高峰向后推14個(gè)小時(shí)。需要推遲移種時(shí)間時(shí)，溫度可以降至33降速為0.5h。2.1.3三級(jí)發(fā)酵工藝初始條件：溫度32.5 灌壓0.05Mpa 轉(zhuǎn)速 50rpm 通氣量 0.55vvm

37、溶氧100 PH 7.0左右。發(fā)酵過(guò)程中溶氧的控制：接種后，溶氧從100開(kāi)始下降，隨著菌體的生長(zhǎng)，溶氧低于45時(shí)，采用轉(zhuǎn)速和空氣流量交替上升的方式來(lái)提高溶氧，轉(zhuǎn)速每次提高5轉(zhuǎn)，具體參照下表，表中條件從左至右，從上至下逐條使用，當(dāng)表中條件用完后，溶氧仍低于45時(shí)，（溶氧低于15時(shí)）開(kāi)始補(bǔ)水，補(bǔ)速1200Lh。 中后期，溶氧逐步回升，當(dāng)期高于50，按照如下方法，將溶氧控制在45，具體參照下表，表中條件從左至右逐條使用，轉(zhuǎn)速每次降低5轉(zhuǎn)，溫度每次降低0.3。罐壓 0.05 溫度 32.5通氣量 1.0轉(zhuǎn)速逐漸降低，每次降低5轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速通氣量轉(zhuǎn)速50600.660700.657080

38、0.78090通氣量轉(zhuǎn)速溫度通氣量罐壓補(bǔ)水0.890100331.00.061200三、發(fā)酵中PH控制接種后PH先下降后上升，然后再次下降，當(dāng)PH降至6.90以下時(shí)，開(kāi)始用糖調(diào)節(jié)PH，PH自控維持在6.90。一、 發(fā)酵中補(bǔ)糖控制當(dāng)PH上升至7.257.45長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有下降時(shí)（22.5h），開(kāi)始補(bǔ)糖，起始速度為200Lh，使PH緩慢降到6.87.0，當(dāng)PH6.90時(shí)，停止補(bǔ)糖，當(dāng)PH回升到6.90時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行自控，將PH控制在6.90液糖濃度（30%）左右。五、發(fā)酵中正丙醇的控制發(fā)酵20h左右開(kāi)始補(bǔ)正丙醇，開(kāi)始正丙醇的殘留量控制在0.51.5gL,40-130h控制在1.52.5gL正丙醇濃度（3

39、0%）左右。正丙醇35周期后具體加量根據(jù)殘留量來(lái)定 。周期（h）2035365454放罐正丙醇(L/h)2446469294144二、 發(fā)酵中豆油的控制發(fā)酵25h左右開(kāi)始補(bǔ)豆油，在45120h，豆油的補(bǔ)速按照表中的高限來(lái)補(bǔ)，其余時(shí)間當(dāng)豆油的殘留量為0時(shí)，補(bǔ)速提高10具體參照下表。周期(h)253536132132放罐豆油(L/h)3040568868122豆油在55周期后具體加量根據(jù)殘留量來(lái)定。六、 放罐條件：生物量在35%左右，粘度到（180cp）左右，鏡檢菌絲有自溶現(xiàn)象發(fā)生，周期在189h左右，效價(jià)9000ú/ml,溶氧一直上升而沒(méi)有下降趨勢(shì)。2.2紅霉素發(fā)酵操作要點(diǎn)2.2.1紅

40、霉素發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)組分2.2.1.1碳源營(yíng)養(yǎng)碳在細(xì)胞中的干物質(zhì)中約占50%，所以微生物對(duì)碳的需求最大。凡是作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，都稱為碳源。其作用一方面是作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源，另一方面是提供菌體生長(zhǎng)，產(chǎn)物分泌所需要的能量。作為微生物營(yíng)養(yǎng)的碳源物質(zhì)種類很多，從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物（CO2、碳酸鹽）到復(fù)雜的有機(jī)含碳化合物（糖、糖的衍生物、脂類、醇類、有機(jī)酸、芳香化合物及各種含碳化合物等）都可作為碳源。根據(jù)碳素的來(lái)源不同，可將碳源物質(zhì)分為無(wú)機(jī)碳源物質(zhì)和有機(jī)碳源物質(zhì)兩類。發(fā)酵中使用的碳源物質(zhì)通常是各種有機(jī)碳源物質(zhì)。葡萄糖（液糖）：紅霉素采用流加液糖方式，其作用在于調(diào)節(jié)發(fā)

41、酵液的pH，另一方面作為碳源之一。 多糖工業(yè)發(fā)酵用的多糖：有糊精、淀粉及其水解液。玉米淀粉及其水解液是抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制劑等發(fā)酵中常用的碳源。玉米淀粉：糊精 英文名稱：dextrin;amylin 定義：淀粉經(jīng)酶法或化學(xué)方法水解得到的降解產(chǎn)物，為數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)葡萄糖單位的寡糖和聚糖的混合物。包括有麥芽糖糊精、極限糊精等。 糊精通常分為三類：白糊精、黃糊精和英國(guó)膠或稱“不列顛膠”。它們之間的差異在于對(duì)淀粉的預(yù)處理方法及熱處理?xiàng)l件不同。脂類（豆油）：霉菌和放線菌可利用油脂做碳源。在發(fā)酵過(guò)程中，加入油脂有消泡和補(bǔ)充碳源的雙重作用。在紅霉素的生產(chǎn)當(dāng)中，豆油是原料之一，其作用一方面是消泡，另一方

42、面可以被鏈霉菌利用作為碳源，提供合成紅霉素的前體。有機(jī)酸、醇： 正丙醇：正丙醇是原料之一，作為合成紅霉素的前體，其也可被鏈霉菌菌利用作為碳源。2.2.1.2氮源營(yíng)養(yǎng)氮元素是微生物細(xì)胞蛋白和核酸的主要成分，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有特別重要的意義。因此我們可以將氮源分為無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源兩種，兩者在發(fā)酵中都有應(yīng)用。（1）無(wú)機(jī)氮源常見(jiàn)的無(wú)機(jī)氮源主要包括氨水、銨鹽等。無(wú)機(jī)氮源的利用速度一般比有機(jī)氮源快，因此無(wú)機(jī)氮源又被稱作速效氮源。某些無(wú)機(jī)氮源由于微生物分解和選擇性吸收的原因，其利用會(huì)逐漸造成環(huán)境pH的改變。例如：在紅霉素生產(chǎn)中，在基礎(chǔ)料中加入硫酸銨的方式補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源，在部分文獻(xiàn)中也采用間接流加硫酸銨的方

43、式來(lái)補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源。 無(wú)機(jī)氮源雖然價(jià)格便宜、利用迅速，但是并非所有的微生物都能利用這類簡(jiǎn)單的氮源。（2）有機(jī)氮源有機(jī)氮源是另一大類發(fā)酵氮源，主要是各種成分復(fù)雜的工農(nóng)業(yè)下腳料，種類非常多，如玉米漿、各種豆粉、玉米粉、實(shí)驗(yàn)室常用的牛肉膏、蛋白胨等等。總的來(lái)說(shuō)，微生物在有機(jī)氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)要比無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)基上旺盛，這主要是由于有機(jī)氮源的成分一般比較復(fù)雜，營(yíng)養(yǎng)也較無(wú)機(jī)氮源豐富。有機(jī)氮源中除含有一定比例的蛋白質(zhì)、多肽及游離氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂類以及各種無(wú)機(jī)鹽、維生素、堿基等。由于微生物可以直接從培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)成分,所以微生物在有機(jī)氮源上的生長(zhǎng)一般較好，更有一些微生物必須依賴有機(jī)氮源提供的

44、營(yíng)養(yǎng)才能生長(zhǎng)。黃豆餅粉是發(fā)酵工業(yè)最常用的有機(jī)氮源。根據(jù)油脂含量可將其分為三種，全脂黃豆粉（含油脂18%以上），低脂黃豆粉（含油脂9%以下），脫脂黃豆粉含油脂2%以下）蛋白胨、酵母粉等使工業(yè)上常用的有機(jī)氮源。2.2.2紅霉素發(fā)酵操作注意事項(xiàng)2.2.2.1紅霉素發(fā)酵PH控制對(duì)pH的要求視不同菌種而異，一般為6.4-6.8，紅霉素發(fā)酵的最適PH值一般認(rèn)為在6.95左右，有時(shí)也可以略高或略低一些，但應(yīng)盡量避免pH值超過(guò)7.0，因?yàn)榧t霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中，pH值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過(guò)高的流加速率會(huì)造成酸性中間產(chǎn)物的積累，以至于pH值降低；過(guò)低的加

45、糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起pH值上升。加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵中的pH值確定，最好是根據(jù)CER、OUR、RQ及KLA來(lái)控制，一般在殘?zhí)橇拷抵?.6%左右，pH值上升時(shí)開(kāi)始加糖。2.2.2.2紅霉素發(fā)酵豆油的控制發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫，可以用天然油脂如豆油，玉米油或用化學(xué)合成消泡劑“泡敵”來(lái)消泡，應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入，避免出現(xiàn)DO低谷，尤其在發(fā)酵前期不易多用，否則會(huì)影響菌體的呼吸代謝即體現(xiàn)在DO上.在好氧性發(fā)酵中泡沫的存在可以增加氣液接觸面積，增加氧的KLA。但當(dāng)發(fā)酵旺盛時(shí)也會(huì)因產(chǎn)生大量泡沫而引起逃液，給發(fā)酵造成困難，帶來(lái)不利因

46、素，防礙了氧氣的溶解，造成代謝異常；增加污染雜菌的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致產(chǎn)物的損失；而且在發(fā)酵過(guò)程中泡沫的消長(zhǎng)規(guī)律為：初期易產(chǎn)生泡沫，但一般易碎，中期產(chǎn)生泡沫較少，后期大量產(chǎn)生泡沫，且不易破碎。因而在發(fā)酵生產(chǎn)中（提高罐壓，降低通氣量短時(shí)間間歇性停止攪拌都可減少泡沫的影響）加入適量的玉米油，控制在一定范圍。采用少量多次的加入。發(fā)酵期間應(yīng)盡量不加油類消沫劑以免菌體代謝能力下降。（機(jī)械消泡的優(yōu)點(diǎn)為不引入外界物質(zhì)，不增加培養(yǎng)液的復(fù)雜程度，不影響產(chǎn)物的提?。蝗秉c(diǎn)則為不能從根本上消除泡沫穩(wěn)定的因素，僅適用于泡沫產(chǎn)生較少較易破碎時(shí).2.2.2.3紅霉素發(fā)酵溫度的控制前期32.5，后期28.5，以減少后期發(fā)酵液中紅霉素的降解破壞。紅霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別，但一般認(rèn)為應(yīng)在32.5左右，溫度過(guò)高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率，同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至紅霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和紅霉素合成來(lái)說(shuō)，最適溫度不是一樣的，一般前者略