第2章 基因工程制藥9,10,11,12,13節(jié)

第九節(jié)高密度發(fā)酵一、概述高密度發(fā)酵：培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L（細胞干重/L）以上，最高200gDCW/L外源基因表達產量與單位體積產量正相關；單位體積產量與細胞濃度和單個細胞平均表達產量正相關。高密度發(fā)酵是在單個細胞平均表達產量不變的前提下，通過單位體積的菌體數量的倍增，實現總表達量的提高。高密度發(fā)酵特點菌體高密度，總表達量高生物反應器體積小單位體積生產能力高生產周期短，分離成本小一、影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基：C源、N源種類和含量；C:N含量比值；微量元素；無機鹽（磷影響表達質粒的復制速率）2.溶氧濃度：空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質能力；菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻細胞光合作用產氧供菌體呼吸。3.pH值：大腸桿菌產酸、CO2必須加堿調節(jié)pH值4.溫度：控制菌體生長，溫控誘導表達（誘導時機和持續(xù)時間，對數生長期，2min）5.代謝副產物：C源物質供應超過三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈能力，產生乙酸，抑制菌體生長和蛋白表達。采取流加補料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。二、實現高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進（1）培養(yǎng)基的選擇：6g/L的甘油作碳源（縮短工程菌的利用時間），各組分濃度較普通提高2～3倍。（2）建立流加式培養(yǎng)方式：營養(yǎng)液（補料）分批維持菌體高生長速率時添加。補料分批發(fā)酵包括：反饋補料（恒速補料、變速補料、指數補料）；非反饋補料（恒溶氧法、pH法、菌體濃度反饋法）。（3）提高供氧能力：加壓、純氧、H2O2、提高氧傳質能力等。2.構建產乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻斷乙酸生產的主要途徑：用基因敲除技術或基因突變技術使大腸桿菌的磷酸轉乙酰酶（PTA）基因pta1和乙酸激酶(ACK)基因acka失活，使丙酮酸到乙酸的合成途徑被中斷。（2）對碳代謝流進行分流：丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ可將丙酮酸轉成乙醇，毒性小于乙酸。（3）限制進入糖酵解途徑的碳代謝流：用基因敲除技術將磷酸轉移酶系統(tǒng)（PST）酶Ⅱ的ptsG基因破壞，降低葡萄糖的攝取速率。（4）引入血紅蛋白基因：透明顫菌血紅蛋白基因vgb導入大腸桿菌，提高氧傳質能力，耐缺氧環(huán)境。3.構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌rpoH基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的r32亞基，r32亞基對多種蛋白水解酶的活力正調控。構建rpoH基因缺陷的突變株，降低蛋白水解酶的活力。第十節(jié)基因工程藥物的分離純化基因工程藥物都是多肽或蛋白質，其特點為：①表達產物在初始物料中含量較低；②含有大量細胞及代謝產物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽；③表達產物穩(wěn)定性差，易失活、變性；④表達產物的種類繁多、結構不一、活性各異；⑤應用廣，對其質量純度要求高、無菌、無熱源。一、建立分離純化工藝的根據（各種因素）⒈含目的產物的起始物料的特點（上游過程的各種因素對分離、純化工藝的影響）包括：①菌種的類型及其代謝特性、產物、副產物。②原材料和培養(yǎng)基的來源及其質量是否穩(wěn)定。③生產工藝和條件。④初始物料的理化性質、生物學性質。⒉物料中雜質的種類和性質。⒊目的產物特性。⒋產品質量的要求二、分離純化的基本過程

發(fā)酵液細胞分離胞內產物胞外產物

細胞破碎

固液分離

濃縮初步分離高度純化制劑產品包含體細胞碎片分離變性復性三.細胞破碎

1.物理破碎法（1）高壓勻漿法（2）高速珠磨法（3）超聲破碎法（4）高壓擠壓法2.化學破碎法（1）滲透沖擊（2）增溶法（3）脂溶法3.生物破碎法：酶溶法四.固液分離1.離心沉淀法2.膜過濾法3.雙水相萃取五、重組蛋白的分離純化技術①技術條件溫和能保持產物生物活性。②選擇性好，能從復雜的混合物中有效的將目的產物分離，達到較高的純化倍數。③收率要高。④兩個技術間能直接銜接，不需要對物料加以處理。⑤純化過程要快，滿足高生產率的要求。目的產物的分離純化蛋白質分離純化方法的設計根據其分子的理化性質和生物學特性來決定。產物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水、反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時間產物的特性在分離純化中的作用分離純化的方法：色譜分離方法

⑴離子交換層析（ionexchangechromatography，IEC）離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質核酸分離純化的重要方法。

⑵反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色譜和疏水色譜是根據蛋白質疏水性的差異來分離純化的。反相色譜是利用溶質分子中非極性基團與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質分子中極性基團與流動相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分離的。常用固定相為硅膠烷基鍵合相。流動相為低離子強度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑。由于固定相骨架疏水性強，吸附的蛋白質需用有機溶劑才能洗脫下來。疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質分子表面上的疏水區(qū)域和介質中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。固定相介質表面的疏水性比反相色譜介質表面的疏水性弱。為有機聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。流動相為pH6～8鹽水溶液。高鹽濃度時，蛋白質分子中疏水性部分與介質的疏水基團產生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時，蛋白質疏水性作用減弱，目的蛋白質被逐步洗脫下來，蛋白質疏水性越強，洗脫時間越長。與反相色譜相比，疏水層析回收率較高，蛋白質變性可能性小。⑶親和層析（affinitychromatography，AC）親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。配基：在親和層析中起可逆性結合的特異性物質。載體：與配基結合的支撐物。親和層析可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸⑷凝膠過濾層析凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質，小分子能進入孔內，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。根據蛋白質的相對分子量和蛋白質分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。主要應用兩個方面：

①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質分子的分級分離。在產品的形成階段前用于除去產物的多聚體及降解產物。六、非蛋白質類雜質的去除⑴

DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質的去除：熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖Gˉ菌細胞壁成分）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除：層析或過濾可將病毒去除,紫外線照射使病毒失活。七、選擇分離純化方法的依據⒈根據產物表達形式來選擇分泌型表達產物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低，純化前必須濃縮，可用沉淀和超濾法?？扇苄员磉_產物破菌后的細胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。

產物在周質表達是介于細胞內可溶性表達和分泌表達的一種形式,它可以避開可溶性表達蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質,在一定程度上有利于分離純化。為了獲得周質蛋白，經低濃度溶菌酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來獲得。⒉根據分離單元之間的銜接選擇應選擇不同機制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。先將最多的雜質去除，將費用最高、最費時的分離單元放在最后階段。即通常先運用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要雜質（包括非蛋白類雜質）。隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾色譜。⒊根據分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝應遵循以下原則：⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復性⑵盡可能減少組成工藝的步驟⑶各技術步驟間要相互適應和協(xié)調⑷工藝過程中盡可能少用試劑⑸工藝所用時間要短⑹工藝和技術必須收率高、易操作、能耗低⑺具有較高的安全性第十一節(jié)變性蛋白的復性一、包含體形成的原因：在高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白正確折疊的速率就形成包含體；重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些折疊酶和分子伴侶形成包含體。二、包含體的分離和溶解

1.包含體的分離：重組菌破碎、洗滌，蔗糖密度梯度離心法純化2.包含體的溶解：用強變性劑（鹽酸胍、脲）或去垢劑（SDS）三、包含體蛋白復性方法

1.稀釋、透析復性法2.含二硫鍵的蛋白的復性3.封閉蛋白的疏水簇促進復性4.凝膠過濾層析復性5.小分子添加劑促進的復性6.折疊酶或分子伴侶促進的復性7.人工分子伴侶促進的復性第十二節(jié)基因工程藥物的質量控制基因工程藥物是利用活細胞作為表達系統(tǒng)，產物的分子量較大，并有復雜的結構。參與生理功能的調節(jié)，用量極微。宿主細胞中表達的外源基因，在轉錄、翻譯、精制、工藝放大過程中可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質量?！吨袊镏破芬?guī)程》中國生物制品標準化委員會，2000，10，1執(zhí)行。一、醫(yī)藥生物技術產品質量保證的一般要點1.產品安全性評價2.產品本身的結構3.嚴格控制條件二、原材料的質量控制確保編碼藥品的DNA序列的正確性重組微生物來自單一克隆所用質粒純而穩(wěn)定保證產品質量的安全性和一致性。

根據質量控制要求應了解以下特性：⒈目的基因的來源、克隆經過，并以限制性內切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；⒉表達載體的名稱、結構、遺傳特性及各組成部分（如復制子、啟動子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物；⒊宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性；⒋須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結合后的遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達載體兩側端控制區(qū)內的核苷酸序列，詳細敘述在生產過程中啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平。三、培養(yǎng)過程的質量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復生產發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。生產基因工程產品應有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產用工作細胞庫。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對生產種子，應詳細敘述細胞生長與產品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產濃度與產量恒定性數據，依據宿主細胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數；在培養(yǎng)過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細胞-載體穩(wěn)定性與產品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細胞系統(tǒng)和產品。培養(yǎng)周期結束時，應監(jiān)測宿主細胞-載體系統(tǒng)的特性，例如：質粒拷貝數、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

四、純化工藝過程的質量控制產品要有足夠的生理