省教育廳科學(xué)研究項目2匯總

1、省教育廳編號項 目 類 別理工類農(nóng)林醫(yī)類人文社科類省教育廳科學(xué)研究項目申請 書項目名 稱：SARSS狀病毒感染免疫學(xué)快速診斷試劑盒的研制申請者:所在單位: 電話:傳真:電子信箱（Email）:申請日 期:2002年制填報說明一、申請書各項內(nèi)容，要實事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)。外來語要同時用原文和中文表達(dá)。第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出全稱。除簽名外，項目申請書必須是打印件。二、申請書一律用 A4 紙，于左側(cè)裝訂成冊。第二頁起各欄空格不夠時，請自行加頁。三、封面上“教育廳編號”由教育廳填寫， “項目類別”在相應(yīng)的位置填寫“重點” 、 “青年” 、 “一般” 。2)簡表項目名稱SARS冠狀

2、病毒感染免疫學(xué)快速診斷試劑盒的 研制類別基礎(chǔ)研究應(yīng)用研究試驗發(fā)展研究年限2003年5月 至 2004 年6月申請經(jīng)費(fèi)14力兀項目 負(fù)責(zé)人姓名年齡48技術(shù)職務(wù)教授已獲學(xué)位碩士所學(xué)專業(yè)病原生物學(xué)現(xiàn)從事專業(yè)病原生物學(xué)主 要 研 究 人 員姓名年齡技術(shù)職務(wù)已獲學(xué)位專業(yè)簽名30講師碩士病原生物學(xué)30講師碩士病原生物學(xué)28助教碩士臨床檢驗33高級實驗師碩士衛(wèi)生檢驗37副教授碩士病原生物學(xué)57教授本科病原生物學(xué)主 要 研 究 內(nèi) 容本研究擬通過生物信息學(xué)軟件分析并尋找我國分離SARS3狀病毒株的S蛋白和M蛋白基因共同的保守序列，RT-PCR擴(kuò)增該基因，克隆至真核表達(dá)載體，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，用純化蛋白抗原

3、制備的單克隆抗體來制備免疫金復(fù)合物，開發(fā)斑點免疫層析試紙條檢測病毒的相應(yīng)抗原；問時將純化的抗原包被微孔板，用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測患者血清中的相應(yīng)抗體，二者互為結(jié)合用于SARS冠狀病毒感染的早期診斷。本研究將為基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)診斷SARS冠狀病毒感染提供準(zhǔn)確、特異、快速、方便、價廉的診斷試劑，為控制SARSB狀病毒在地級以下城市及廣大農(nóng)村的傳播和感染提供有力的工具。是否我廳在建重點學(xué)科，學(xué)科名稱：否、立論依據(jù)（包括項目的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析）自2002年末在我國廣東省發(fā)現(xiàn)首例非典型肺炎病例以來，該疾病至今已經(jīng)廣泛擴(kuò)散到香港、越南、 東南亞及加拿大和美國等近30個國家和地區(qū)，至5月2日世

4、界衛(wèi)生組織（WHO ）統(tǒng)計全球患者已多達(dá) 6054多例，且發(fā)病人數(shù)仍有不斷增加的趨勢1。該病主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高達(dá)10%, WHO將這種傳染病稱為重癥急性呼吸綜合征（ Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS）。中國香港和大陸、加拿大、美國等國家的研究機(jī)構(gòu)病原學(xué)調(diào)查研究表明引起該病的病原體是冠狀 病毒家族的一個新的變種，命名為SARS冠狀病毒2,3,4> 5o冠狀病毒是引起人類上呼吸道感染的病原，其感染在全世界各個地區(qū)廣泛分布，主要發(fā)生在冬季和早 春季節(jié)，通常引起成人的普通感冒，也是成人慢性氣管炎患者急性加重

5、的重要病原。冠狀病毒分三個組群，組群1和2包括哺乳動物病毒，而組群3僅包括禽類病毒。人冠狀病毒分別屬于組群1和2,有OC43和229E兩個抗原型，引起約 30%中度上呼吸道感染疾病。SARS冠狀病毒也是一種單正鏈RNA病毒，但研究結(jié)果表明該病毒是一個新的病毒變種：SARS冠狀病毒可在 Vero細(xì)胞中生長；病毒編碼的制酶基因和S、E、M、N蛋白四基因的聚類分析表明該病毒和已知的三個組群有明顯差別；用已知的冠狀病毒抗原檢測 不到患者恢復(fù)期血清中的抗體2。SARS冠狀病毒感染具有很高的傳染性和較高的死亡率，而且目前尚無特異性治療和預(yù)防手段，因此 迫切需要早期診斷以控制傳染源和切斷傳播途徑，減少對易感

6、人群的危害。對 SARS冠狀病毒的早期診斷 主要包括細(xì)胞培養(yǎng)方法分離病毒、逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增病毒的RNA、血液中抗體檢測等三種6。病毒的細(xì)胞培養(yǎng)是診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)要求高，生長時間長，陽性率很低，不適于早期診斷。逆轉(zhuǎn)錄PCR具有高敏感性和特異性的優(yōu)點，可以在感染后1到2天檢測體內(nèi)的病毒，雖然可以輔助臨床診斷，但是病毒RNA提取困難、易降解，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；且操作易污染，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果?？贵w檢測有間接 免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA ）兩種，前者可以檢測出病毒感染10天后產(chǎn)生的IgM型抗體，后者可以可靠地檢出感染 14-21天后SARS病人血清中的病毒抗體（IgM/IgG ）

7、，但這兩種方法都不能用于早期 診斷。細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR和間接免疫熒光試驗均需要特殊的設(shè)備和條件，且操作人員需要專業(yè)培訓(xùn)并具 備一定的經(jīng)驗，因此在廣大基層很難推廣，這又于地級以下的城市和廣大農(nóng)村預(yù)防SARS帶來很多不便，因此開發(fā)一種簡單、方便、廉價的診斷試劑有非常重要的實用價值并且有很大的市場前景?？焖侔唿c免疫層析試驗 （dot immunochromatographic assay, DIBA）是一種免疫膠體金測定方法 7,使用 硝酸纖維膜作為載體，利用微孔膜的毛細(xì)作用，使滴加在試紙條一端的標(biāo)本向另一端滲移，途中與膠體金 復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)顏色變化。該技術(shù)從 80年代問世以來一直受到檢驗人員

8、的重視，其技術(shù)發(fā)展很快，從 藥物的測定到傳染病病原抗原、抗體檢測，激素和腫瘤標(biāo)志物檢測等，應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。斑點免疫層析試驗由于其快速、操作簡便、不需特殊設(shè)備、且可單份測定，可以用于早期診斷SARS病毒的感染，符合基層醫(yī)療結(jié)構(gòu)的需要。本研究擬建立用于檢測SARS冠狀病毒的S蛋白和M蛋白抗原的斑點免疫層析試驗，同時建立相應(yīng)的診斷血清中 S蛋白和M蛋白抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，二者互為補(bǔ)充來診斷 SARS冠狀病毒的感染。上考文獻(xiàn)：1. Cumulative Number of Reported Probable Cases of Severe Acute Respiratory Syndrome

9、 (SARS). /csr/sarscountry/2003 05 02/en/2. Rota PA , Oberste MS, Monroe SS, et al. Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute RespiratorySyndrome . http:/ / 1 May 2003 / Page 1/ 10.1126/science.10859523. Peiris J, Lai S, Poon L, et al.

10、 Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361(9366):1319-13254. Poutanen SM, Low DE, Henry B, et al.Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med 2003;3485. Ksiazek G, Erdman D, Goldsmith CS , et al. A Novel Coronavirus Associa

11、ted with Severe Acute Respiratory SyndromeThomas .N Engl J Med 2003;3486. 中國生物信息網(wǎng).SARS病毒的背景和初步分析.7. 陶義訓(xùn).金免疫技術(shù).陶義訓(xùn)主編：免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗，人民衛(wèi)生出版社，p174-18411三、研究方案1 .研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：1）建立斑點免疫層析試驗檢測SARS冠狀病毒抗原2）建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA ）檢測SARS冠狀病毒抗體研究內(nèi)容：1）基因序列比較分析 GeneBank中我國SARS病毒分離株刺突糖蛋白（S蛋白）和小膜蛋白（M蛋白）基因的保守序列，設(shè)計特異

12、性引物。2）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增抗原保守序列，克隆至 T載體，再亞克隆至 Psv2-EP真核 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，表達(dá)蛋白、純化蛋白。3）純化蛋白抗原免疫動物，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，純化及鑒定單克隆抗體。4）用單克隆抗體制備免疫金復(fù)合物，制成斑點免疫層析試驗試紙條（雙抗體夾心法），測試其靈敏度和特異性；將純化蛋白抗原包被微孔板， 用ELISA間接法檢測SARSW毒S蛋白和M蛋白的抗體，測試其檢 測敏感性和特異性。5）臨床試驗檢測評估其質(zhì)量，批量制備試劑盒。擬解決的關(guān)鍵問題：1）體外表達(dá)出具有完整抗原性的SARS冠狀病毒S蛋白和M蛋白2）改進(jìn)斑點免疫層析試驗和酶聯(lián)免

13、疫吸附試驗的敏感性和特異性2 .擬采取的研究方法及可行性分析研究方法：1）病毒培養(yǎng)：Vero E6細(xì)胞在含10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基內(nèi)37c培養(yǎng)4872h,長成單層后 即可感染SARS冠狀病毒株。感染病毒后在33c繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，出現(xiàn)細(xì)胞變圓、腫脹、成堆、說落現(xiàn)象者，70 c冷凍保存。2）序列分析：應(yīng)用ClustalW分析下列SARS冠狀病毒株基因的 S蛋白和M蛋白序列，選擇保守區(qū)域： SARS coronavirus BJ01 ; SARS coronavirus BJ02 ; SARS coronavirus BJ03 ; SARS coronavirus BJ04 ; S

14、ARS coronavirus CUHK-W1 ; SARS coronavirus GZ01 ; SARS coronavirus HKU-39849 ; SARS coronavirus Hong Kong/03/2003 ; SARS coronavirus Taiwan ; SARS coronavirus Tor2 ; SARS coronavirus Urbani ; SARS coronavirus Vietnam。3） RT-PCR:以Primer5.0在靶基因保守區(qū)域兩端設(shè)計引物，提取細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒RNA ,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA , PCR擴(kuò)增特異性保守序列，產(chǎn)物 T-A克隆

15、至T載體，再亞克隆至 Psv2-EP真核表達(dá)載體，電穿 孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選 G418抗性細(xì)胞表達(dá)蛋白，分離純化蛋白。4）細(xì)胞融合及制備單克隆抗體：將純化的蛋白抗原免疫小鼠，加強(qiáng)免疫后處死，取脾臟制備脾細(xì)胞懸 液，加入PEG骨髓瘤細(xì)胞懸液混合，置于含HAT選擇培養(yǎng)基的微孔板中培養(yǎng)，篩選陽性細(xì)胞建株，制備單克隆抗體，純化并鑒定單克隆抗體。5）膠體金和免疫金制備：取 100ml 0.01 %氯金酸（HAuCl4 ）加熱至沸，攪動下加入 2ml 1 %檸檬酸 三鈉水溶液繼續(xù)加熱煮沸 15min,冷至室溫后用蒸儲水補(bǔ)足 100ml即為膠體金溶液。取調(diào)節(jié)膠體金溶液pH到 8.0 ,加入1/10體積5%純化

16、抗原蛋白溶液，放置室溫反應(yīng) 25min,加入0.2 % PEG飽和游離的膠體金， 離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。沉淀用PBS懸浮，離心洗滌，反復(fù) 3次，用稀釋液配制終濃度為0.5 %免疫金卜夜。6）斑點免疫層析：取 6mmK 70mm塑料板條，在上端和下端分別粘貼吸水材料，將吸附免疫金的干片 貼于近下端，緊貼其上為硝酸纖維素膜條（免疫金干片側(cè)為檢測區(qū)，包被有特異抗體；近上端為參照區(qū)， 包被有抗小鼠IgG。檢測病毒時將板條下端浸入標(biāo)本中，待液體向上端移動，檢測帶和參照帶均為紅色線 條者為抗原陽性。7）酶聯(lián)免疫吸附試驗：將純化的 S蛋白或M蛋白抗原包被到聚苯乙烯微孔，過夜， PBS洗滌除去游 離的蛋白質(zhì)

17、。微孔加待檢血清 50 孵育30min后，加入50 M HRP標(biāo)記的羊抗人IgG ,孵育30min洗滌 液洗滌5次，拍干后加入 50 U H 2O2和鄰苯二胺避光顯色 10min后，酶標(biāo)儀測 OD值，判斷結(jié)果。8）敏感性和特異性檢測：系列稀釋已知含量的病毒抗原，檢測斑點免疫層析試紙條的敏感性；應(yīng)用 冠狀病毒科的成員人冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、貓傳 染性腹膜炎病毒、貓腸道冠狀病毒、狗冠狀病毒、牛冠狀病毒、兔冠狀病毒、大鼠涎腺炎病毒、鼠肝炎病 毒、火雞冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎病毒等檢測斑點免疫層析試紙條的特異性；系列稀釋已知含量的病 毒抗體，檢測ELI

18、SA的敏感性，應(yīng)用冠狀病毒科成員的抗體檢測其特異性?？尚行苑治觯?）斑點免疫層析試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗已經(jīng)成功地用于免疫學(xué)臨床檢驗，技術(shù)成熟。2 ）3）申請者所在單位具備從事本項研究所需要的設(shè)備和條件。研究優(yōu)勢：學(xué)校領(lǐng)導(dǎo)對科研工作極為重視，把搞好科研工作作為振興學(xué)校的關(guān)鍵，對于獲得的課題學(xué)校將從政策、 “費(fèi)、人員和場地等方面予以大力支持。研究工作起步早技術(shù)成熟，具備相關(guān)設(shè)備。醫(yī)院檢驗科、深圳市 "民醫(yī)院檢驗科建立廣泛關(guān)系，有病原體臨床檢測室，對該項目開展具備相應(yīng)條件。且與在美國得克薩斯 作的鐘光明教授有科研協(xié)作，對此項研究的科研試劑與技術(shù)關(guān)鍵具備了有利條件。3 .本項目的創(chuàng)新之處目前

19、對SARS冠狀病毒感染的實驗室診斷方法主要為細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，RT-PCR擴(kuò)增RNA,和間接免疫熒光檢測抗體，但這些試驗均需要特殊設(shè)備和熟練的專業(yè)人員，且試驗費(fèi)用昂貴，不能推廣到基層應(yīng) 用。我們開發(fā)的斑點免疫層析試驗檢測試劑盒可用于感染的早期診斷，具有準(zhǔn)確、特異、快速的特點，且 操作簡便、不需特殊設(shè)備、可單份測定，還可用于患者自檢，因此有著廣泛的應(yīng)用前景和廣闊的市場空間。4 .預(yù)期的研究進(jìn)展和成果預(yù)期的研究進(jìn)展：2003.05 2003.06分析基因序列，設(shè)計引物，培養(yǎng)病毒2003.072003.10 RT-PCR擴(kuò)增靶基因，構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)并純化抗原2003.11 2003.12制備單克隆抗體2004.01 2004.04制備斑點免疫層析板條和ELISA微孔板，檢測試驗的靈敏度和特異性2004.052004.06臨床試驗評估，批量生產(chǎn)試劑盒預(yù)期的成果:成功制備斑點免疫層析和酶聯(lián)免疫吸附試劑盒用于臨床診斷SARS冠狀病毒的感染，并可培養(yǎng)碩士研究生2至IJ 3名，發(fā)表論文3至IJ 4篇。四、研究基礎(chǔ)