免疫組織化學(xué)問題解答

1、免疫組織化學(xué)問題解答免疫組織化學(xué)是一種什么方法？免疫組織化學(xué)方法是一種把分子水平的物質(zhì)準(zhǔn)確具體表達(dá)出來的一種方法，這些分子水平的物質(zhì)可能與癌細(xì)胞，細(xì)菌，病毒等等有關(guān)。自從成功地制作出這些特異性的抗體，使組織結(jié)構(gòu)可以從分子水平中顯示出來，這些特異性抗體可以與腫瘤細(xì)胞中特定的結(jié)構(gòu)結(jié)合，這些抗體被稱為單克隆抗體。把這些單克隆抗體孵育在組織切片上，與特定的靶細(xì)胞進(jìn)行特異的反應(yīng)。如單克隆抗體可以與癌細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，單克隆抗體可以從特定的腫瘤病人血細(xì)胞中獲得。在組織切片中結(jié)合的抗體可以用棕色或紅色顯示出來。比如，對轉(zhuǎn)移到骨組織中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，我們可以用前列腺特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記，如顯示出棕色或

2、紅色的陽性反應(yīng)，我們可以明確地判斷這個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤來自前列腺癌，有些轉(zhuǎn)移的腫瘤距原發(fā)部位可能更遠(yuǎn)。免疫組織化學(xué)不僅能幫助準(zhǔn)確地診斷出腫瘤的性質(zhì)，還可以預(yù)測腫瘤預(yù)后的生物學(xué)行為。例如，我們可以知道所有組織細(xì)胞的增殖活性。這不是更有意義的實(shí)驗(yàn)嗎？我們能夠判定在一種腫瘤組織中，80%的細(xì)胞增殖抑制了其他10%的腫瘤細(xì)胞的增殖，我們可以判定出這種腫瘤細(xì)胞增殖率高，要比其他腫瘤生長迅速，進(jìn)展快。在其他方面，免疫組織化學(xué)染色可以指導(dǎo)某些腫瘤的化療，如：可以測定女性乳腺癌細(xì)胞中攜帶雌激素受體的含量。如果癌細(xì)胞中雌激素表達(dá)陽性，病人可以進(jìn)行三苯氧胺的治療，雌激素能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長，三苯氧胺有封閉癌細(xì)胞中雌

3、激素受體的功能。在此過程中，攜帶雌激素受體的癌細(xì)胞是通過激素促進(jìn)它生長的，而且，癌細(xì)胞增生可以通過三苯氧胺治療來阻止其生長的。因此，免疫組織化學(xué)測定雌激素受體的表達(dá)情況，可以預(yù)測三苯氧胺治療的意義。這僅僅是免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一個(gè)小例子。免疫組織化學(xué)在確定組織起源中的應(yīng)用前景是無限的。免疫組化技術(shù)是一個(gè)復(fù)雜的生物技術(shù)，對每一個(gè)抗體標(biāo)記物都有獨(dú)自特定的染色方法，目的是能夠明確各種組織起源，判定組織中是否存在特異抗原。病理醫(yī)生是如何對癌癥做出診斷的?癌癥病人就診時(shí)，外科醫(yī)生會(huì)在腫瘤部位取一小塊組織，送給病理科醫(yī)生。在病理科，送檢的組織經(jīng)過石蠟包埋，制作成非常薄的組織切片，切片再進(jìn)行HE染色，然后病

4、理科醫(yī)生將切片放在顯微鏡下觀察，觀察送檢的標(biāo)本中有沒有腫瘤細(xì)胞，并做出診斷是患何種腫瘤。不幸的是，許多腫瘤組織細(xì)胞在顯微鏡下看起來非常相似，以致于病理醫(yī)生難以完全準(zhǔn)確地判斷出腫瘤的性質(zhì)。在許多腫瘤病例中，鑒別診斷是非常困難的，因?yàn)橹挥忻鞔_了腫瘤的性質(zhì)，醫(yī)生才能針對每種腫瘤制定出最有效的治療方案，目前已經(jīng)從分子水平研究出腫瘤細(xì)胞的表面和細(xì)胞內(nèi)有特異性的物質(zhì)表達(dá)。過去在傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡下及電鏡下所看到的組織切片中的結(jié)構(gòu)，曾經(jīng)幻想的分子水平的結(jié)構(gòu)，已經(jīng)有現(xiàn)代免疫組織化學(xué)技術(shù)證明，這個(gè)技術(shù)的整個(gè)過程就叫做免疫組織化學(xué)方法。CD抗原CD，即分化叢（clusters of differentiation）

5、。第屆國際免疫學(xué)會(huì)議命名委員會(huì)（1983，京都），根據(jù)T細(xì)胞表面的分化抗原存在叢集現(xiàn)象，將這種抗原命名為CD抗原。CD抗原不僅存在于T細(xì)胞，也存在于B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。交叉反應(yīng)指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：1 抗原特異性。指用于免疫動(dòng)物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。2 共同決定簇。即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。3 決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某

6、一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。· 抗原決定簇。它是指在抗原分子上為免疫系統(tǒng)識(shí)別和作用的基團(tuán)，是抗原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。抗原決定簇的種類有1016?/FONT>1018種之多。決定簇的數(shù)目稱為決定簇的價(jià)數(shù)，較大的分子決定簇較多，如紅細(xì)胞上的A或B血型抗原，其決定簇?cái)?shù)目可能超過100萬。 · 多抗和單抗特性比較 1. 均一性。一種單抗中，每個(gè)抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類。即單抗是一種純度很高的均一抗體。而從不同動(dòng)物，不同時(shí)期所得到的多抗，各有不同的化學(xué)組成。多抗是多種種類和亞類I

7、g的混合物。 2. 穩(wěn)定性。單抗的穩(wěn)定較差，對PH變化敏感，對熱不穩(wěn)定，提純過程中易變性，而多抗的穩(wěn)定性則較好。 3. 特異性。單抗是單一地針對抗原的某一決定簇，所以用它進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí)，特異性強(qiáng)，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)。而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)。 4. 重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好，而多抗每批都不一樣。 沉淀反應(yīng)多抗由于與抗原多價(jià)結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體，不能直接形成抗原抗體沉淀物?？贵w的保存抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L）

8、，就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4-8條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可

9、在4下保存數(shù)月。病理科成立免疫組化室需要哪些小設(shè)備（儀器）1 冰箱（4、-18）：貯存免疫試劑用。2 18cm不銹鋼高壓鍋+電爐或家用微波爐。（抗原修復(fù)用）3 孵育盒（有機(jī)材料）；不銹鋼或塑料耐高溫切片架。4 沖洗瓶兩個(gè)，定時(shí)器一個(gè)，10ml玻璃試管五個(gè)，塑料試管架。5 1000ul國產(chǎn)移液器兩支，200ul進(jìn)口移液器一支，20ul進(jìn)口移液器一支，相應(yīng)吸嘴。6磨砂玻片。7. PAP油筆。 如何應(yīng)用免疫組化進(jìn)行病理科研設(shè)計(jì)？科研課題的基本要求至少有四個(gè)，即創(chuàng)新性、科學(xué)性、可行性和推廣應(yīng)用性。關(guān)于創(chuàng)新性的重要性很好理解，誰喜歡東施效顰、拾人牙慧、人云亦云的文章？誰不想標(biāo)新立異，“國內(nèi)外尚無類似報(bào)道

10、”？可對于病理科醫(yī)生尤其是基層病理科醫(yī)生，采用免疫組化技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新性的科研，似乎免為其難。其實(shí)如果調(diào)整一下思維角度，難者也就不難了。我們在這里甘冒才疏學(xué)淺之嫌，介紹幾種簡單可行的創(chuàng)新性方法，以請教于病理界同仁。方法之一，采用新抗體，這是最簡單的辦法。如金屬蛋白酶MMP-9抗體是一種新抗體，其抗原MMP-9與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，但采用此抗體和免疫組化研究腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的文章國外少見，國內(nèi)尚無，讀者不妨一試。方法之二，舊抗體新用途。比如關(guān)于凋亡及其相關(guān)因子表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系的研究，國內(nèi)外有大量報(bào)道，而關(guān)于其非腫瘤疾病的關(guān)系的研究，卻報(bào)道很少，有的甚至迄今未見報(bào)道。如果你將P53、bcl

11、-2、c-myc、Bax、ICE等凋亡相關(guān)基因蛋白抗體用于非腫瘤性疾病研究，一定會(huì)獲得新發(fā)現(xiàn)。再比如，P-糖蛋白抗體絕大多數(shù)用于腫瘤耐藥性研究，卻極少用于非腫瘤性疾病的研究。正常肝、腸道、腎等均表達(dá)P-糖蛋白，在非腫瘤性疾病時(shí)這種表達(dá)有什么改變，這種改變又有什么意義，迄今尚未了解，讀者也不妨在這方面施展你的身手。方法之三，同時(shí)應(yīng)用多種抗體進(jìn)行普通免疫染色或雙重免疫染色研究二種或二種以上抗原的協(xié)同表達(dá)，只要這幾種抗體選用合理，也比較容易獲得新發(fā)現(xiàn)。評(píng)價(jià)某種免疫學(xué)試驗(yàn)質(zhì)量的指標(biāo)1 診斷敏感性。指患者中因此試驗(yàn)得到陽性結(jié)果的百分率。計(jì)算方法：TP/（TP+FN）100%。理想試驗(yàn)的診斷敏感性為100%。2 診斷特異性。指正常人與無關(guān)疾病的患者中因此試驗(yàn)得到陰性結(jié)果的百分率。非患者的陰性結(jié)果為真陰性，其陽性結(jié)果為假陽性。計(jì)算方法：TN/（TN+FP）100%。理想試驗(yàn)的診斷特異性應(yīng)為100%。3 診斷指數(shù)。為評(píng)價(jià)某種試驗(yàn)敏感性與特異性的綜合指標(biāo)。理想的指數(shù)應(yīng)為200%，100%的試驗(yàn)不能成立。4 診斷效率。某種試驗(yàn)?zāi)軠?zhǔn)確區(qū)分患者和非患者的能力。計(jì)算方法：（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN