提取基因組PPT課件

1、第一部分 DNA提取總論第1頁/共143頁一、提取DNA總的原則：1 1 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類 分分子的污染應(yīng)降低到最低程度；子的污染應(yīng)降低到最低程度；3 3 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；溶劑和過高濃度的金屬離子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也應(yīng)盡量去除。也應(yīng)盡量去除。第2頁/共143頁二、樣本來源： 理論上所有有核真核細胞、細菌、病毒都可以提取DNA 樣本選擇取決于試驗?zāi)康?全血是基因組

2、提取最常見的樣本第3頁/共143頁 血清、血漿、外周血有核細胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織（包括骨髓）和羊水等都是分子診斷的檢驗材料，其中全血、血漿（血清）標(biāo)本占分子診斷的60%以上 第4頁/共143頁DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：（一）全血 1.抗凝劑 EDTA-Na2 或枸櫞酸鈉 作為抗凝劑 不宜使用肝素 第5頁/共143頁mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCRRT-PCR結(jié)果（0 0、3 3、6 6個月）A B C DA B C D第6頁/共143頁（二）血漿和血清 血漿和血清是檢測釋放入血的游離核酸最主要的標(biāo)本來源，用來檢測病毒、細菌，以及腫瘤細胞等等釋放出來的游離核

3、酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于病原微生物和腫瘤標(biāo)志基因的檢測中 第7頁/共143頁 血漿DNA又稱為循環(huán)DNA，是一種無細胞狀態(tài)的胞外DNA，主要是游離的單鏈、雙鏈DNA或DNA-蛋白質(zhì)的混合物 它在未來分子診斷的應(yīng)用中具有廣闊前景 血漿DNA成分的來源分為內(nèi)源性和外源性兩個部分，其中入侵的病毒、細菌等病原體釋放入血液的核酸是外源性血漿DNA最重要的成分第8頁/共143頁血漿DNADNA內(nèi)源性循環(huán)DNADNA外源性循環(huán)DNADNA自身基因組來源DNADNA入侵的病毒、細菌等病原體死亡細胞活細胞釋放第9頁/共143頁（三）體液 尿液、胸水、腹水和腦脊液等標(biāo)本離心后取沉淀提取體液中細胞的核酸

4、 對釋放入體液中的病毒或細菌的游離核酸，采用超高速離心或體液濃縮后再提取核酸第10頁/共143頁（四）分泌物（以痰液為例） 痰液是檢測呼吸道病原體核酸的主要樣本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前應(yīng)先漱口，以避免混入大量的口腔脫落的上皮細胞和唾液等影響檢測結(jié)果 第11頁/共143頁 結(jié)核分枝桿菌的檢測，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白質(zhì)；非結(jié)核分枝桿菌的核酸，使用生理鹽水后取上清液 痰液檢測病原體核酸不適宜作定量分析，檢測時盡可能提高痰液中細胞成分的回收率第12頁/共143頁三、DNA的收率第13頁/共143頁四、DNA提取的基本步驟1、核酸的釋放：核酸的釋放： 破裂細胞破裂細

5、胞 釋放核酸釋放核酸 機械法與非機械法機械法與非機械法 （非機械法中（非機械法中溶胞法溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法）是應(yīng)最廣泛的方法）第14頁/共143頁各種組織細胞破碎方法各種組織細胞破碎方法第15頁/共143頁破裂細胞 、釋放核酸第16頁/共143頁2、核酸的分離與純化：、核酸的分離與純化： 將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其 他物質(zhì)分離他物質(zhì)分離 非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂脂 類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液液第17頁/共143頁3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌、核酸的

6、濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用少數(shù)鹽類可使用70-75%70-75%的乙醇洗滌的乙醇洗滌第18頁/共143頁4、DNA鑒定 DNA的鑒定的鑒定 濃度鑒定濃度鑒定 純度鑒定純度鑒定 完整性鑒定完整性鑒定第19頁/共143頁濃度鑒定1 1）紫外分光光度法：測定）紫外分光光度法：測定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。 如計算如計算DNADNA濃度濃度 A A260260稀釋倍

7、數(shù)稀釋倍數(shù)5050 g/mlg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20g/ml單鏈寡核苷酸）第20頁/共143頁 各種堿基的紫外吸收光譜第21頁/共143頁2 2）熒光光度法）熒光光度法 熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）第22頁/共143頁EB與DNA的結(jié)合第23頁/共143頁500

8、l全血提取的基因組DNA電泳動物組織提取基因組DNA第24頁/共143頁純度鑒定紫外分光光度法：紫外分光光度法： 在在260260nmnm和和280280nmnm處測定處測定DANDAN溶液的光吸收，純?nèi)芤旱墓馕?，純的的DNADNA，低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有份。高于此值表明有RNARNA的殘留量。的殘留量。 A A260260與與A A280280之比應(yīng)在之比應(yīng)在1.801.80；純的；純的RNA ARNA A260260與與A A280280之比應(yīng)在之比應(yīng)在2.02.0。 A260/A280A260/A280比值是純度檢測的重要指標(biāo)

9、。比值是純度檢測的重要指標(biāo)。第25頁/共143頁完整性鑒定凝膠電泳法：凝膠電泳法： 基因組基因組DNADNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象； 總總RNARNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNARNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNADNA污染。污染。第26頁/共143頁第27頁/共143頁5、核酸的貯存DNA保存 1 1）短期貯存：）短期貯存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）緩

10、沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖液的緩沖液的PHPH與與DNA DNA 貯存有關(guān)，貯存有關(guān)，PHPH為為8 8時，可減少時，可減少DNADNA脫氨反應(yīng)，脫氨反應(yīng)，PHPH低于低于7.07.0時時DNADNA容易變性。容易變性。2 2）長期貯存：）長期貯存： TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年；在保存數(shù)年；在DNADNA溶液中加一滴溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。第28頁/共143頁第二部分 基因組DNA的分離與純化第29頁/共143頁一、DNA樣品準(zhǔn)備 常見的標(biāo)本：常見的標(biāo)本： 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細胞等血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)

11、細胞等 生物組織：生物組織： 最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存 70 70或液氮或液氮第30頁/共143頁二、DNA提?。ㄒ唬┓映樘岱ǎ海ㄒ唬┓映樘岱ǎ?先用先用EDTAEDTA、 SDS SDS 、蛋白酶蛋白酶K K破碎細胞，消化蛋白，然后用破碎細胞，消化蛋白，然后用pH8pH8的的TrisTris飽和飽和酚或酚酚或酚- -氯仿抽提氯仿抽提DNADNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNADNA大小為大小為100100150150kbkb。第31頁/共143頁DNA酚抽提法示意圖第32頁/共143頁主要試劑的作用：主要試劑的作

12、用： EDTAEDTA：1 1 二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；二價金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2 2 降低細胞膜的穩(wěn)定性降低細胞膜的穩(wěn)定性第33頁/共143頁SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂2 2溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來釋放出來3 3 對對RNARNA、DNADNA酶有抑制作用酶有抑制作用4 4 與蛋白質(zhì)形成與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3 R-O-SO3 .R.R蛋白質(zhì)復(fù)合物，蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性使蛋白質(zhì)變性第34頁/共143頁蛋白酶蛋白酶K K： 水解蛋白質(zhì)的作用，消化

13、水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNADNA酶和細胞中的蛋白酶和細胞中的蛋白質(zhì)質(zhì) 蛋白酶蛋白酶K K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能能 力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在時仍保持較高活性，存在時仍保持較高活性，可可 同時使用同時使用第35頁/共143頁苯酚的特點：苯酚的特點： 蛋白質(zhì)強變性劑、抑制蛋白質(zhì)強變性劑、抑制DNADNA酶活性酶活性 苯酚溶于有機溶劑，微溶于水苯酚溶于有機溶劑，微溶于水 提取提取DNADNA前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-Hcl飽和，防止吸收過多飽和，防止吸收過多DNADNA，降低降低DNADNA的損失率的損失率

14、 氧化苯酚會破壞氧化苯酚會破壞DNADNA第36頁/共143頁為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？ 苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。第37頁/共143頁 PH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液可以似的抽提出的DNADNA進入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。進入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。 在酚或酚在酚或酚- -氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。氯仿中加入少許的異戊醇

15、，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。第38頁/共143頁DNA的沉淀1）無水乙醇沉淀）無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負電荷，有助于分子之間的聚集。表面的負電荷，有助于分子之間的聚集。 無水乙醇可以吸收分子之間的水，使無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋沉淀析出過程釋放熱量對放熱量對DNA的損傷。的損傷。2）異丙醇沉淀）異丙醇沉淀 除了使除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的沉淀外，還可以

16、溶解少量的小的RNA分分子子第39頁/共143頁（二）（二） 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法： 破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與白質(zhì)與DNADNA的結(jié)合，再透析獲得的結(jié)合，再透析獲得DNADNA。高濃度高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNADNA的復(fù)合物，可的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟 甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的的DNADNA樣品。可得樣品?？傻肈NA 200kbDNA 200kb左右。左右。第40頁/共143頁（三）（

17、三） 玻璃棒纏繞法：玻璃棒纏繞法： 用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U U型玻璃棒在界面型玻璃棒在界面輕攪，輕攪，DANDAN沉淀液繞于玻棒。生成沉淀液繞于玻棒。生成DNADNA約約8080kbkb第41頁/共143頁DNA玻棒纏繞法示意圖第42頁/共143頁第43頁/共143頁（四）（四） 表面活性劑快速制備法：用表面活性劑快速制備法：用Triton X-100Triton X-100或或NP40NP40表面活性劑破碎細胞，表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶然后用蛋白酶K K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析?；蚍尤コ鞍祝掖汲恋?/p>

18、或透析。第44頁/共143頁二、DNA的濃縮1 1、固體聚乙二醇（、固體聚乙二醇（PEGPEG）濃縮：用透析袋濃縮：用透析袋 外敷外敷PEGPEG至合適量至合適量2 2、丁醇抽提濃縮：、丁醇抽提濃縮：DNADNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNADNA不會。因此不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少重復(fù)幾次可顯著減少DNADNA體積體積第45頁/共143頁三、DNA回收 主要是從電泳中分離回收主要是從電泳中分離回收DNADNA片段片段回收原則：盡量提高回收率回收原則：盡量提高回收率 去除回收去除回收DNADNA樣品中的污染物樣品中的污染物第46頁/共143頁第47

19、頁/共143頁1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法（一）（一） 從瓊脂糖凝膠中回收從瓊脂糖凝膠中回收DNADNA片段片段第48頁/共143頁電泳到電泳到DEAE-DEAE-纖維素膜纖維素膜 ： DEAEDEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負電荷的有負電荷的DNADNA分子分子 在所需條帶前插入在所需條帶前插入DEAT-DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶泳至條帶DNADNA都到膜上，取出洗下都到膜上，取出洗下 500 500bp-5kbbp-5kb的的DNADNA片段回收率較好，

20、純度高。片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過但不適用于分子量超過1010kbkb和單鏈和單鏈DNADNA 第49頁/共143頁透析袋電洗脫透析袋電洗脫 ： 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNADNA出膠后進行抽提出膠后進行抽提DNADNA回收。回收。 第50頁/共143頁低熔點瓊脂糖凝膠：低熔點瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到切下膠，加熱到6565熔化膠，然后抽提回收熔化膠，然后抽提回收DNADNA。 方法：有機溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊方法：有機溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。脂水解酶等。 第51頁/

21、共143頁第52頁/共143頁瓊脂水解酶：將含瓊脂水解酶：將含DNADNA的凝膠進行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放的凝膠進行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNADNA，后使用酚抽提方法回收后使用酚抽提方法回收DNA DNA 第53頁/共143頁第54頁/共143頁第55頁/共143頁（二）（二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收從聚丙烯酰胺凝膠回收DNADNA片段片段 聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。雖費時但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。第56頁/共143頁 至今尚無一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時回收幾種DNA片段并有效清除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑。第5

22、7頁/共143頁DNA提取試驗中常遇到的問題 基因組DNA收率較低或無基因組DNA 樣本材料太少 細胞破裂不夠充分，DNA釋放不完全 離心力偏小 兩相分離不完全 第58頁/共143頁 DNA降解的原因 樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊 樣本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因組DNA鹽濃度過高 基因組DNA中乙醇未清除凈 基因組DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因組DNA，有時加入蔗糖的原因 加入多糖，保護DNA長度第59頁/共143頁第60頁/共143頁質(zhì) 粒 DNA 制 備plasmid extraction 第61頁/共143頁質(zhì)粒簡介質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)

23、(plasmid)是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNADNA分子分子 其大小范圍從其大小范圍從lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。 已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒. . 這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)行復(fù) 制和遺傳的輔助性遺傳單位。制和遺傳的輔助性遺傳單位。 第62頁/共143頁Chromosome DNA genomePlasmid DNA第63頁/共143頁 質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載質(zhì)粒是攜帶外源基因進

24、入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)用、最基本的實驗技術(shù) 第64頁/共143頁質(zhì)粒特性1. 1. 分子相對小分子相對小 2. 2. 含有高效的自主復(fù)制成分含有高效的自主復(fù)制成分 3. 3. 不相容性不相容性(incompatibility)(incompatibility)4. 4. 轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移性5. 5. 選擇的標(biāo)記選擇的標(biāo)記(selective markers)(selective markers)6. 6. 限制性內(nèi)切酶單一切口限制性

25、內(nèi)切酶單一切口第65頁/共143頁質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點 分子量相對較小 共價閉合分子 雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強的抗切割和抗變性能力超螺旋DNA分子 線性DNA分子 半開環(huán)DNA分子第66頁/共143頁第67頁/共143頁表達載體載體含有tac啟動子、Lac操縱基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等 Exprssion vector第68頁/共143頁 細菌收集純化質(zhì)粒DNA細菌培養(yǎng)細菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化 第69頁/共143頁質(zhì)粒DNA的提取和純化 一、細菌的培養(yǎng)一、細菌的培養(yǎng) (bacterial culture)(bacterial culture)l l 先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗

26、生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細先分離單個菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質(zhì)粒菌的生長，質(zhì)粒DNADNA也在自主復(fù)制。也在自主復(fù)制。第70頁/共143頁 對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細胞的控制，故在細對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素（菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體色體DNADNA的復(fù)制。質(zhì)粒的復(fù)制。質(zhì)粒DNADNA的復(fù)制不受影響而大量擴增的復(fù)制不受影響而大量擴增第71頁/共143頁l 所以使用氯霉素的主要目的，是

27、在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細菌的所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細菌的培養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量培養(yǎng)體積和細菌的數(shù)量 有時質(zhì)粒在細菌中的擴增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分有時質(zhì)粒在細菌中的擴增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致。子量過大所致。第72頁/共143頁二、細菌的收集(bacterial collection) 細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNADNA的純度，離心棄上清，的純度，離心棄上清，細菌沉淀最好用細菌沉淀最好用STESTE或生理鹽水懸浮，漂洗或生理鹽水懸浮，漂

28、洗l-2l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細去除干凈。仔細去除干凈。 第73頁/共143頁三、細菌裂解 細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇綜合后加以選擇。 第74頁/共143頁質(zhì)粒提取的方法 堿裂解法 (Alkaline ) 煮沸裂解法 SDS裂解法 其他第75頁/共143頁質(zhì)粒DNA

29、提取方法的選擇 l 常用的煮沸法，堿法常用的煮沸法，堿法, ,SDSSDS法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提取小量細菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，取小量細菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒， 用煮沸法或用煮沸法或SDSSDS法進行質(zhì)粒法進行質(zhì)粒DNADNA的大量分離，只的大量分離，只是各個實驗室的習(xí)慣問題是各個實驗室的習(xí)慣問題. .第76頁/共143頁l選擇哪種方法制備質(zhì)粒選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNADNA，應(yīng)考慮以下因素：應(yīng)考慮以下因素： 1 1菌株類型（菌株類型（typetype） 2 2質(zhì)粒的大小質(zhì)粒的大小( (size)size) 3 3細菌染色體細菌染色體DNADNA變性條件強

30、弱的控制變性條件強弱的控制 ( (denaturation condition)denaturation condition)質(zhì)粒DNA的小量制備 2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備 500ml第77頁/共143頁 大質(zhì)粒（15kb）的處理方法： 采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少 小質(zhì)粒（15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。第94頁/共143頁（四）其它方法1、 小量一步提取法第95頁/共143頁1、 小量一步提取法 直接將酚/氯仿與細菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上

31、清液中回收質(zhì)粒DNA。本法簡單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩詢?nèi)切酶圖譜分析。第96頁/共143頁（二）牙簽少量制備法 用牙簽直接挑取生長在瓊脂平板上的細菌菌落制備質(zhì)粒DNA。 由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。第97頁/共143頁質(zhì)粒DNA的純化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱層析法第98頁/共143頁EBCsCl密度梯度離心法 EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。 CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達100%。第99頁/共143頁 超速離心將介質(zhì)C

32、sCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。第100頁/共143頁EBCsCl密度梯度離心法示意圖第101頁/共143頁第102頁/共143頁l 轉(zhuǎn)基因動物，真核細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)基因動物，真核細胞轉(zhuǎn)染及DNADNA外切酶酶外切酶酶切缺失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈切缺失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈DNADNA的要求的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。 對于對于DNADNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、片段

33、酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實驗，細菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實驗，直接用小量或中量提取的直接用小量或中量提取的DNADNA樣品，并不需樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。第103頁/共143頁2 2 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 分級沉淀，首先利用分級沉淀，首先利用LiClLiCl沉淀大分子沉淀大分子RNARNA，用用RnaseRnase酶消化小分子酶消化小分子RNARNA；在在利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒DNADNA，再利用酚再利用酚- -氯仿抽提。氯仿抽提。 方法簡單實用，但是不

34、能區(qū)分環(huán)狀或開鏈質(zhì)粒方法簡單實用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開鏈質(zhì)粒DNADNA第104頁/共143頁3 柱層析法 以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，在多鹽的條件下，以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，在多鹽的條件下，DNADNA與硅基質(zhì)可逆性的與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進行純化。結(jié)合進行純化。 多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用用50%50%的乙醇洗去的乙醇洗去RNARNA和糖類物質(zhì)，再加入和糖類物質(zhì)，再加入TETE或水，離心洗脫?；蛩x心洗脫。第105頁/共143頁第106頁/共143頁RNA的分離與純化RNA is

35、olation and purificationRNA isolation and purification第107頁/共143頁第108頁/共143頁每個細胞的RNA量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA第109頁/共143頁第110頁/共143頁一、關(guān)于RNase酶 RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中 RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵 RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)

36、。 Rnase不需要二價陽離子激活第111頁/共143頁第112頁/共143頁 去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵。 必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。1.內(nèi)源性RNA酶（intrinsic RNase）第113頁/共143頁2.外源性RNA酶(extrinsic RNase)主要來源： 被污染的緩沖液 細菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶， 必須丟棄 自動移液裝置第114頁/共143頁3.實驗室采取避免RNA酶污染的措施 設(shè)置專門RNA移液裝置 小份保存緩沖液 設(shè)置專門的RNA電泳裝置 準(zhǔn)備溶液或緩沖液時，使用無RNA酶的器

37、皿、 DEPC處理水等 分離RNA過程中使用RNA酶抑制劑第115頁/共143頁1. 1. 變性劑(denaturant)(denaturant) 選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑） 使用蛋白酶K(proteinase K) 使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、RNA酶抑制劑和變性劑第116頁/共143頁 胍類變性劑(carbamidine)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑。 蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機卷曲狀態(tài)。 鹽酸胍抑制RNA酶作用強，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷

38、裂氫鍵。第117頁/共143頁 聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。2.RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)第118頁/共143頁（1）DEPC（焦碳酸二乙酯） 高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的

39、過程中不使用DEPC。第119頁/共143頁（2）RNA酶的蛋白抑制劑 許多RNA酶可以與該類蛋白質(zhì)結(jié)合形成非共價復(fù)合物從而是RNA酶失活。 RNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。 商品化的RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如RNAsin等）。第120頁/共143頁3.還原劑 加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。第121頁/共143頁RNA提取實驗前的準(zhǔn)備【使用器具】 盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，則使用0.1%DEPC水溶液在37處理12h，后120高壓30min，去除殘留DEPC【試劑配制】 無菌水須用0.1%

40、DEPC處理后高溫高壓滅菌 RNA實驗試劑應(yīng)RNA提取專用，避免其他試劑交叉污染【其他】 實驗過程中使用一次性手套，并經(jīng)常更換；在RNA專用區(qū)操作，操作過程中避免交談 第122頁/共143頁三、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 首先以含異硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細胞。 然后在pH4.0的條件下，酚/氯仿抽提細胞裂解溶液。 最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA。第123頁/共143頁 本法具有簡便、快速、經(jīng)濟、高效及提取的RNA質(zhì)量高等優(yōu)點，能在3小時內(nèi)迅速處理多個標(biāo)本。 總RNA產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每mg組織大約能制備47g總RNA，每106個細胞大約為410g。 第124頁/共143頁四、商品化的單相裂解試劑法分RNA 本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改進方案。 以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細胞，再加入氯仿后形成兩相。第125頁/共143頁 變性的DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面，可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來。 保留于上層水相的RNA，通過異丙醇沉淀