液相色譜原理

1、高效液相色譜法高效液相色譜法學(xué)生學(xué)生: :古力齊曼古力齊曼 內(nèi)容目錄內(nèi)容目錄 1.前言前言 2.發(fā)展發(fā)展 3.理論發(fā)展簡(jiǎn)況理論發(fā)展簡(jiǎn)況 4.主要類型主要類型5.特點(diǎn)特點(diǎn)6.流程與儀器流程與儀器7.組成部分組成部分8.分類分類9.實(shí)例實(shí)例 一：前言一：前言 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）又叫做高壓或高速液相色譜、高分離度液相色譜或近代柱色譜,以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，是色譜法的一個(gè)重要分支。 它是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測(cè)樣品

2、，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。這種方法已成為化學(xué)、生化、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)、生物化學(xué)和環(huán)境化學(xué)工作者手中必不可少的工具。 二：發(fā)展簡(jiǎn)史二：發(fā)展簡(jiǎn)史 1906年俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜”（Chromotography）、“色譜圖”（Chromatogram）和“色譜法”（Chromatographic method）的概念。他在論文中寫到：一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順

3、序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖。 30年代以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。 1952年英國(guó)學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們?cè)诜峙渖V方面的研究工作，提出了關(guān)于氣液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。 1958年基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試，但分離效率尚不理想。 60年代中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐的發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和

4、化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。 70年代中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。 90年代以后，生物工程和生命科學(xué)在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，如人類基因級(jí)計(jì)劃，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等。三：液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況三：液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況 高效液相色譜法(HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。 它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力,需用高壓輸送流動(dòng)相,故又稱高壓液相色譜法(HPLC)。又因分析速度快

5、而稱為高速液相色譜法(HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。 四：主要類型四：主要類型 1吸附色譜(Absorption Chromatography) 2分配色譜(Partition Chromatography) 3離子色譜(Ion Chromatography) 4體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography) 5親和色譜(Affinity Chromatography) 五：特點(diǎn)五：特點(diǎn) 高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)： 1高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。 2高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)

6、到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 3高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在L數(shù)量級(jí)。 4應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。 5分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成，一般小于1h。 六：流程與儀器六：流程與儀器 運(yùn)行過程：如左圖所示，溶劑貯器（1）中的流動(dòng)相被泵（2）吸入,經(jīng)3梯度控制器按一寫的梯度進(jìn)行混后然后輸出,經(jīng)（4）測(cè)其壓力和流量,導(dǎo)入（5進(jìn)樣閥（器）經(jīng)（6）保護(hù)柱;（7）

7、分離柱后到（8）檢測(cè)器檢測(cè),由（10）數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或（11）記錄儀記錄色譜圖;（12）餾分收集器收集餾分，;13）為廢液。 七：組成部分七：組成部分 1. 高壓輸液泵：（1）功能：驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)；（2）性能要求：流量穩(wěn)定（1），耐高壓（3060Mpa），耐各種流動(dòng)相 例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液；（3）種類：往復(fù)泵和隔膜泵。 2. 色譜柱（1） 功能：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)；（2） 尺寸：1030cm長(zhǎng)，25mm內(nèi)經(jīng)的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱；（3） 填料粒度：510m，高效微粒固定相； 3. 進(jìn)樣器（1）功能：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；（2）種類：注射器，10Mpa以下，110l微量注射器進(jìn)樣；停流進(jìn)樣；閥進(jìn)樣，常用、較理想、體積可變，可固定；自動(dòng)進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。 4. 檢測(cè)器（1）功能：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號(hào)； （2）分類： 示差折光化學(xué)檢測(cè)器 紫外吸收檢測(cè)器 紫外一可同分光光度檢測(cè)器 二極管陣列紫外檢測(cè)器 熒光檢測(cè)器 電化學(xué)檢測(cè)器 5. 餾分收集器 （1）功能：如果所進(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析,而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備,餾分收集是必要的; （2）方法：手工，少數(shù)幾個(gè)餾分,手續(xù)麻煩,易出差錯(cuò)。餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。 6. 數(shù)據(jù)獲取和處理系