氨基酸的離子交換柱色譜分離實(shí)驗(yàn)教案

1、氨基酸的離子交換柱色譜分離【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理；2. 掌握離子交換柱層析法的基本操作；3. 掌握氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理及洗脫曲線的繪制?！緦?shí)驗(yàn)原理】1. 離子交換層析原理離子交換層析是一種用離子交換樹脂做支持劑的層析法.離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.樹脂一般都制成球形的顆粒.陽(yáng)離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亞磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羥基(一OH)等,可解離出H離子,當(dāng)溶液中含有其他陽(yáng)離子時(shí),例如在酸性環(huán)境中的氨基酸陽(yáng)離子,它們可以和H離子發(fā)生交

2、換而"結(jié)合"在樹脂上本實(shí)驗(yàn)采用磺酸型陽(yáng)子交換樹脂（732型）分離酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和堿性氨基酸(賴氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3條件下，由于pH低于Lys的pI值，Lys可解離成陽(yáng)離子，吸附在樹脂上；又由于pH高于Asp的pI值，則Asp可解離為陰離子，不能被樹脂吸附而直接流出色譜柱。在pH12條件下，因pH高于Lys的pI值，Lys又解離為陰離子從樹脂上被交換下來，這樣通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。2. 茚三酮反應(yīng)機(jī)理在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。此反應(yīng)

3、為一切蛋白質(zhì)和氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應(yīng)。該反應(yīng)顏色產(chǎn)物在570nm處有最大吸收峰?！緝x器與試劑】1. 儀器：層析柱（20cmX1cm）；鐵架臺(tái)；恒流泵；部分收集器；分光光度計(jì)；移液槍；恒溫水浴鍋；試管玻璃棒燒杯等常用器材。2. 試劑：A732型陽(yáng)離子交換樹脂B2mol/L氫氧化鈉溶液 1mol/L氫氧化鈉溶液0.01mol/L氫氧化鈉溶液C2mol/L鹽酸溶液D混合氫基酸溶液：天冬氨酸、賴氨酸均配制成2 mgmL的檸檬酸緩沖液溶液。將上述天冬氨酸、賴氨酸溶液按1：1.5的比例混合E檸檬酸緩沖液（pH5.3，鈉離子濃度為0.45

4、mol/L）F茚三酮顯色劑【實(shí)驗(yàn)步驟】1.樹脂的處理（小老師完成）將干的強(qiáng)酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時(shí)，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。（檢驗(yàn)中性用試紙即可）2.樹脂的轉(zhuǎn)型與保存（小老師完成）以1mol/L氫氧化鈉溶液浸泡處理后的樹脂1h，使樹脂轉(zhuǎn)化為Na型，用蒸餾水洗至中性，多余樹脂放入1mol/L氫氧化鈉溶液保存，需使用的用欲使用緩沖溶液浸泡。3.裝柱?。?0cm X 1cm）層析柱，檢驗(yàn)氣密性。驗(yàn)得氣密性良好后，將柱垂直夾于鐵架上。用夾子夾緊柱底出口處橡皮管，在柱頂放一漏斗并向柱內(nèi)加入2-3cm高的緩沖溶液

5、。用小燒杯取少量樹脂及浸泡液，將其攪拌成懸浮狀，通過漏斗緩慢倒入柱內(nèi)。待樹脂在底部沉降時(shí)，慢慢打開出口夾子，放出少許液體，持續(xù)加入樹脂，直至樹脂高度達(dá)到10cm。注意：裝好的柱要求連續(xù)、均勻，無紋格、無氣泡，表面平整，否則倒回?zé)?，重新裝柱。整個(gè)過程液面不可低于樹脂床面。4.平衡層析柱裝好后，緩慢加入適量緩沖液至液面高于樹脂面2-3cm。取一燒杯盛有25ml緩沖液，裝好柱子，柱上端膠皮管通過恒流泵浸入燒杯液面以下，柱下端置另一燒杯收集洗出液。后開啟泵，調(diào)節(jié)流速，以0.5ml/min（10滴/min）流速進(jìn)行平衡，待25ml緩沖液基本用盡時(shí)即可加樣。平衡過程大約40-50分鐘。5.加樣關(guān)閉恒流泵

6、，打開層析柱上端，緩慢打開柱底出口夾子，放出層析柱內(nèi)液體至層析柱內(nèi)液體凹液面與樹脂上表面約距1mm，立即關(guān)閉出口。由上端緩慢加入氨基酸混合液0.5ml（用吸量管沿柱壁四周均勻加入）。加樣后打開止水夾，使液緩慢流出至凹液面與樹脂上表面約距1mm ，立即關(guān)閉止水夾。再加入0.5ml緩沖液（用吸量管沿柱壁四周均勻加入），打開止水夾，使液體緩慢流出至凹液面與樹脂上表面再次約距1mm ，重復(fù)此加入緩沖液操作2-3次，最后加緩沖液至液面高于柱頂2cm左右。6.洗脫將層析柱裝好并使下端對(duì)準(zhǔn)部分收集器上的一號(hào)小試管口，用PH5.3檸檬酸鈉緩沖溶液以0.5ml/min（10滴每分鐘）流速開始洗脫，小試管收集洗脫

7、液，每管收集1ml，收集10管后，關(guān)閉恒流泵，同時(shí)夾住下端，改用0.01mol/L氫氧化鈉溶液洗脫，同法繼續(xù)收集11-35管。收集完畢后，關(guān)閉止水夾和恒流泵。(實(shí)驗(yàn)時(shí)柱內(nèi)液體不可流干，柱子氣密性不好時(shí)易出現(xiàn)流干情況)7.氨基酸色譜的測(cè)定向各管收集液中加入2.5ml檸檬酸鈉緩沖溶液，混勻后加入1ml茚三酮顯色劑，在沸水中加熱15min，取出冷卻10min。以收集液第1管為空白，測(cè)定570nm波長(zhǎng)處各管的光吸收值。以光吸收值為縱坐標(biāo)，以洗脫管號(hào)（洗脫體積）為橫坐標(biāo)繪制氨基酸色譜圖。（比色時(shí)請(qǐng)戴手套，避免將液體粘在手上或衣服上，實(shí)驗(yàn)完畢后請(qǐng)將樹脂倒入指定回收處，并清洗所有實(shí)驗(yàn)用具）8.樹脂的回收與再生（小老師完成）樹脂回收后，用1mol/L氫氧化鈉洗滌浸泡，再用蒸餾水洗至中性后，可再次使用?！緮?shù)據(jù)處理】以光吸收值為縱坐標(biāo)，洗脫