放射免疫抗體滴度的確定碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定

1、抗體滴度的確定與碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院2012級2班 張于君實驗原理實驗步驟實驗試劑預計結果注意事項抗體滴度的確定抗體滴度的確定將濃縮抗血清進行倍比稀釋，得到不同稀釋度的抗體溶液。使用定量的標記抗原與各管抗體反應至平衡，分離結合部分，測不同稀釋度抗體與標記抗原結合率（B/T）。B/T=30-50%的抗體滴度即為應用抗體的最佳滴度。實驗原理抗體滴度的確定濃縮抗體125I-Ag緩沖液免疫分離劑實驗試劑抗體滴度的確定 總T 含：125I-Ag1# 1:1 含：濃縮抗體、緩沖液（1:1）2# 1:2 含：濃縮抗體、緩沖液（1:2）3# 1:4 含：濃縮抗體、緩沖液（1:

2、4）4# 1:8 含：濃縮抗體、緩沖液（1:4）5#1.將濃縮抗體做倍比稀釋實驗步驟各管所含成分抗體滴度的確定125I-Ag：100l1.將濃縮抗體做倍比稀釋1#抗體滴度的確定濃縮抗體100l緩沖液100l1:11.將濃縮抗體做倍比稀釋2#抗體滴度的確定4#混勻后取100l加入3#2#混勻后取100l加入4#混勻后取100l加入5#3#5#1:11:21:41:81.將濃縮抗體做倍比稀釋抗體滴度的確定2.加入標記抗原125I-Ag100l實驗步驟4#5#2#3#混勻后，37溫浴60min1#可在此時加入125I-Ag100l并參與溫浴3.加入免疫分離劑1000l實驗步驟抗體滴度的確定充分混勻后

3、，3000rpm離心15min3#4#2#1#棄去上清，在計數(shù)器上分別計數(shù)各管cpm4.計算各稀釋度的結合率B/T實驗步驟抗體滴度的確定總T1:11:21:41:81:161:321:641:128cpm3025416718148901159882085838400224361598B/T(%)55.2649.2238.3427.1319.3013.238.055.28所得數(shù)據(jù)應類似下表所示預計結果抗體滴度的確定5.繪制稀釋曲線圖實驗步驟X：抗體稀釋度Y：抗體各稀釋度對應的結合率B/T可查出B/T=30%-50%相應抗體稀釋度即為所求預計結果抗體滴度的確定注意事項1.加樣量準確2.吸頭不可相互

4、污染3.準確把握免疫分離劑用量及離心時間4.所有用具應按規(guī)范處理，避免放射污染碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定實驗原理實驗步驟實驗試劑結果判定標記物抗原的質(zhì)量鑒定測定一定量蛋白類激素的125I-Ag標記物的總放射性再使用三氯乙酸沉淀其蛋白部分，測得沉淀部分放射性二者之差即為游離碘部分游離碘占碘化標記物的15%以下即為合格實驗原理碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定標記物抗原的質(zhì)量鑒定10%三氯乙酸溶液1%磷酸鹽緩沖液125I標記物樣品實驗試劑碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定標記物抗原的質(zhì)量鑒定碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定1.取樣品測量其總放射性。實驗步驟2.沉淀其蛋白部分棄去上清測定沉淀物放射性。12

5、5I標記物100l+緩沖液0.5ml加10%三氯乙酸10ml測定總放射性棄去上清測定沉淀放射性計算結果標記物抗原的質(zhì)量鑒定碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定游離碘=（1-沉淀物放射性cpm/總放射性cpm）*100%結果判定判定：碘化標記物游離碘15%為合格標記物抗原的質(zhì)量鑒定碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度實驗原理實驗步驟實驗試劑結果作圖注意事項用紙層析法分離碘化標記物的雜質(zhì)，從而計算碘化蛋白部分所占比例，即為該標記物的放化純度。實驗原理碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度1%IK溶液125I標記

6、物展開劑正丁醇：乙醇：氨水=20:1：1濾紙條實驗試劑碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度將濾紙條浸于將濾紙條浸于1%KI溶液溶液中過夜，次日取出晾干。中過夜，次日取出晾干。 從無孔端用鉛筆以從無孔端用鉛筆以1cm等距離等距離畫畫1012條線。條線。 在第一線處在第一線處點樣點樣510ul125I標記物晾干。標記物晾干。 將此濾紙條放入層析槽中，使末端浸于展開劑中約將此濾紙條放入層析槽中，使末端浸于展開劑中約5mm 2小時后小時后取出紙條晾干，然后取出紙條晾干，然后沿線剪開沿線剪開，分別放入相，分別放入相應試管中編號標記。應試管中編號標記。每管內(nèi)加入每管內(nèi)加入0.5mlH2

7、O,分別測定各管分別測定各管cpm數(shù)并記錄數(shù)數(shù)并記錄數(shù)據(jù)及作圖。據(jù)及作圖。實驗步驟實驗步驟碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度浸于1%KI溶液中過夜并晾干以1cm等距離畫1012條線第一線處點510ul125I標記物晾干放入層析槽末端浸入展開液0.5cm2h后取出晾干沿線剪開分別置入試管并標記每管內(nèi)加入0.5mlH2O分別測定各管cpm數(shù)管號管號123456789101112總總ALBcpm3364921324860484890724272361476EPOcpm17462211723951485469305448514473碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度實驗結果將類似下表結果作圖碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度作圖結果如下結果作圖橫軸：各試管號碼縱軸：每管計數(shù)率cpm計算第一峰占總cpm百分比如圖所示：ALB的放化純度=EPO的放化純度=cpm1+cpm2+cpm3cpm總100% 90%cpm1+cpm2+cpm3cpm總100% 65%碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度結果作圖分析： ALB放化純度90%可能原因為：層析時間不足，未充分分離樣品過期，有雜值出現(xiàn)。 EPO放化純度=90%，結果較理想。碘化標記物質(zhì)量及放化純度的鑒定測定125I標記物放化純度點樣時要輕快，點樣面積要盡