試驗(yàn)名稱-堿性磷酸酶的分離純化試驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)名稱-堿性磷酸酶的分離純 化實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱堿性磷酸酶的分離純化、比活性測定 與動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)日期2011年10月25號 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 生化實(shí) 驗(yàn)室合作者指導(dǎo)老師總分教師簽名批改日期堿性磷酸酶（AKP或ALP ）是一種底物特 異性較低，在堿性條件下能水解多重磷酸單脂化 合物的酶，需要鎂和錳離子為激活劑。AKP具有磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移活性，能將底物中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn) 移到另一個(gè)含有羥基的接受體上，如磷酸基團(tuán)的 接受體是水，則其作用就是水解。AKP最適P H范圍為8.6 10，動(dòng)物中AKP主要存在于 小腸粘膜、腎、骨骼、肝臟和胎盤等組織的細(xì)胞 膜上。血清AKP主要來自肝，小部分來自骨骼。 AKP可從組織中分離

2、純化，也可以采用基因工 程表達(dá)的方式獲得：將堿性磷酸酶基因克隆到重組載體，轉(zhuǎn)入宿主菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并從表達(dá) 菌提取，并進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析。一實(shí)驗(yàn)原理1、堿性磷酸酶的分離純化AKP分離純化的方法與一般蛋白質(zhì)的分 離純化方法相似，常用中性鹽鹽析法、電泳法、 色譜法、有機(jī)溶劑沉淀法等方法分離純化。有時(shí) 需要多種方法配合使用，才能得到高純度的酶蛋 白。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑沉淀法從兔肝勻漿液中 提取分離AKP。正丁醇能使部分雜蛋白變性， 過濾除去雜蛋白即為含有 AKP的濾液，AKP能 溶于終濃度為33%的丙酮或30%的乙醇中，而 不溶于終濃度為50%的丙酮或60%的乙醇中， 通過離心即可得到初步純化的 A

3、KP。2、堿性磷酸酶的比活性測定根據(jù)國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，酶的比活性用 每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性來表示，單位（U/mg ?pr）來表示。因此，測定樣品的比活性必須測 定：a每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)；b每毫升 樣品中的酶活性單位數(shù)。酶的純濃度越高酶的比 活性也就越高。本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物，由 堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚 在堿性條件下與4-氨基安替比作用，經(jīng)鐵氰化鉀 氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含 量成正比。于510nm處比色，即可求出反應(yīng)過 程中產(chǎn)生的酚含量，而堿性磷酸酶的活性單位可 定義為：在37攝氏度保溫15min每產(chǎn)生1mg的 酚為一個(gè)酶活性單位。樣品蛋白質(zhì)

4、含量測定用Foli n-酚法測定。3、底物濃度對堿性磷酸酶活性的影響在環(huán)境的溫度、PH和酶的濃度一定時(shí)， 酶促反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系表現(xiàn)為反 應(yīng)開始時(shí)。酶促反應(yīng)的速度（V）隨底物濃度（S） 的增加而迅速增加。若繼續(xù)增加底物濃度，反應(yīng) 速度的增加率將減少。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程 度時(shí)，反應(yīng)速度就會(huì)達(dá)到一個(gè)極限值，即最大反 引發(fā)速度（Vmax）。底物濃度與酶促反應(yīng)速度的 這種關(guān)系可用米氏方程式表示：1 Sv- KmTisT式中：Vmax為最大反應(yīng)速度；S為底物濃度； Km為米氏常數(shù)；V代表反應(yīng)的起始速度。 當(dāng) v =Vmax/2 時(shí)，Km=S。因此，Km 等 于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底

5、物濃 Km是酶的最重要的特征性常數(shù)，測定 Km 值是研究酶動(dòng)力學(xué)的一種重要的方法，大多 數(shù)酶的 Km 值在 0.01-100mmol/L。 Km 和 Vmax的測定：主要采用 Li neweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法。此式為直 線方程，以不同的底物濃度1/S為橫坐標(biāo)，以 1/V為縱坐標(biāo)，并將各點(diǎn)連成一直線，向縱軸 方向延長，此線與橫軸相交的負(fù)截距為 -1/Km，由此可以正確球的該酶的 Km值。方 程式與圖如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，測定不同底物濃度 時(shí)的酶活性，再根據(jù)Lineweaver-Burk 法作圖 計(jì)算其Km值。實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物， 由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸

6、鹽。酚在堿性條件下與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏 色深淺和酚的含量成正比。根據(jù)吸光值得大 小可以計(jì)算出酶的活性，也可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線 上差得酚的含量，進(jìn)而算出酶活性的大小。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）堿性磷酸酶的分解純化和比活性測定1、樣品兔肝2、試劑 0.5mol/L乙酸鎂溶液 0.1mol/L乙酸鈉溶液 0.01mol/L乙酸鎂0.01mol/L乙酸鈉溶液 0.01mol/L Tris 0.01mol/L 乙酸鎂 PH 8 8緩沖液 丙酮（分析純） 95%乙醇（分析純） 正丁醇（分析純） 0.04mol/L底物液 1 mg/ml分標(biāo)準(zhǔn)液 0.5mol/L NaOH? 0.

7、3% 4 氨基安替比林? 0.5%鐵氰化鉀? 0.1mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液?堿性銅試劑?酚試劑3、儀器與器材 研缽 刻度離心管 刻度吸管 電動(dòng)離心機(jī) 玻璃漏斗和玻璃棒 托盤天平 恒溫水浴 可見分光光度計(jì)(二)底物濃度對堿性磷酸酶活性的影響1、樣品兔肝勻漿液2、試劑 0.04mol/L底物液 0.1 mol/L 碳酸鹽緩沖液PH10 (37C) 堿性溶液 0.5%鐵氰化鉀 0.3% 4 氨基安替比林 酚標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml）3、儀器與器材恒溫水浴鍋可見光分光光度計(jì)三、實(shí)驗(yàn)步驟（一） AKP的提取驟AKP提取實(shí)驗(yàn)步步驟操作（1）勻漿2g新鮮兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸鎂 0.01mol/

8、L乙酸鈉溶液6.0ml,研磨成勻 漿。勻漿倒入刻度離心管中，記錄其體積， 此為A液吸取A液0.1ml于另一試管中，加PH8.8Tris緩沖液4.9ml稀釋，此為稀釋 人液（1:50），供此比活性用（2）除雜蛋 白在A液中加入正丁醇 2.0ml，用玻璃棒充 分?jǐn)嚢?min，至溫放置20min，用濾紙過 濾(3)丙酮沉淀AKP濾液置于刻度離心管中，加入等體積的冷 丙酮，立即混勻離心(2000r/min)5min(4 ) AKP沉淀加入0.5mol/L乙酸鎂4.0ml，用玻璃溶解棒充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，記錄其體積，此為B液。取B液0.1ml于另一試管中，加入PH8.8Tris緩沖液4.9ml，此為稀釋B

9、液(1:50)，供動(dòng)力實(shí)驗(yàn)用(二)AKP的比活性測定1、AKP的活性測定AKP活性測定實(shí)驗(yàn)步驟步驟操作(1 )加緩沖液取試管3支，按表操作試劑(ml)測定標(biāo)準(zhǔn)管空白管 管PH8.8Tris -1.0緩沖液0.04mol/L 1.01.01.0底物液(2 )溫 浴37 °C水浴預(yù)溫5min加酶和底物0.1mol/ml -1.0-標(biāo)準(zhǔn)酚應(yīng) 1.0用液待測液酶促 反應(yīng)37 C準(zhǔn)確保溫15mi n(5)加顯色液0.5mol/LNaOH1.01.01.00.3% 4 氨基1.01.01.0安替比林0.5% 鐵氰化鉀2.02.02.0(6)顯色反應(yīng)混勻，室溫放置10min測吸 光度510nm處測

10、吸光度2、蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定實(shí)驗(yàn)步驟步驟操作（1 ）反取3支試管，按表操作應(yīng)體系試劑測定標(biāo)準(zhǔn)空白設(shè)置管管管PH8.8Tris 緩沖液 待測酶液 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液1.01.01.0（0.1mg/ml） 堿式銅試劑5.05.05.0（2 ）反 應(yīng)混勻后室溫放置10min（3 ）加酚試劑0.5ml酚試劑（4 ）顯混勻后室溫放置30min色反應(yīng)（5 ）比在510nm處比色色反應(yīng)（三）底物濃度對堿性磷酸酶活性的影響1、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響將新鮮兔肝用PH10.0 O.1mol/L碳酸緩沖液勻 漿，按20倍稀釋即可酶曲線繪制步驟步驟操作（1）反應(yīng) 體系設(shè)置取6支試管標(biāo)號，按表操作試劑12345

11、（ml）60.01mol/l 0.01 0.20 0.30 0.50 1.00 底物液PH10 0.07 0.70 0.70 0.70 0.700.1mol/L碳酸鹽緩沖液蒸餾水 1.10 1.00 0.90 0.70 0.200.701.20（2）保溫37 °C水浴中保溫5min加酶各管分別加入兔肝稀釋勻漿液 0.10ml（4）酶 促反應(yīng)混勻，立即記錄時(shí)間，將各管準(zhǔn)確保溫15mi n（5）終 止反應(yīng)各管分別加入堿性溶液1.0ml（6）加各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0ml顯色劑各管分別加入0.5%鐵氰化鉀2.0ml（7）顯 色充分混勻，放置15mi n(8)比以6號空白

12、管作對照，于510nm波長處比色測定色測定(9)反根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每樣品酚的含量，應(yīng)速度計(jì)算算出反應(yīng)速度(10)以各管底物濃度的倒數(shù)（1/|S）為橫坐標(biāo)，曲線繪以各管反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，制作圖求出Km值2、酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制的繪制酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制的繪制步驟步驟操作（1 ）反取潔凈干燥試管6支，依次加入試劑應(yīng)體系試劑(ml)123456設(shè)置0.1mol/ml 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40酚標(biāo)準(zhǔn)溶液蒸餾水2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60（2 ）預(yù)37 °C水浴中保溫5min加熱(3)力口 堿性溶 1.01.01.0 1.0 1.01.0顯色劑 液0.3% 4 1.01.01.0 1.0 1.01.0-氨基安替比林0.5% 鐵 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0氰化鉀（4 ）顯 色反應(yīng)混勻后，室溫放置15mi n（5 ）比色測定510nm波長處比色（6 ）曲 線繪制以酚含量（微克）為橫坐標(biāo)