病毒檢測技術(shù)及應(yīng)用實用教案

1、前言(qin yn)01目 錄CONTENTS病毒(bngd)的分離與培養(yǎng)02免疫學(xué)方法(fngf)03病毒核酸分子檢測0405新型核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)第1頁/共23頁第一頁，共24頁。前言(qin yn)01PART 第2頁/共23頁第二頁，共24頁。 病毒學(xué)檢驗技術(shù)是用實驗室檢驗方法對臨床和流行病學(xué)現(xiàn)場送檢的標(biāo)本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進(jìn)行病毒學(xué)的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預(yù)防(yfng)提供科學(xué)依據(jù)。病毒檢驗(jinyn)技術(shù) 病毒檢測技術(shù)反映病毒的核酸水平、感染的狀態(tài)、傳染性和評定治療效果，對病情的診斷、治療和用藥上起著關(guān)鍵性的作用，可根據(jù)檢

2、查結(jié)果判斷和選擇患者適宜的抗病毒藥物種類，并制定適宜的最佳治療方案；可根據(jù)病毒核酸量的動態(tài)變化對患者用藥的劑量、時間及是否需要聯(lián)合用藥等提供重要的參考(cnko)依據(jù)。病毒檢測技術(shù)在評價和觀察抗病毒藥物治療的療效、免疫增強(qiáng)藥物的療效及判定預(yù)后效果都有重要應(yīng)用。第3頁/共23頁第三頁，共24頁。病毒(bngd)檢驗技術(shù)流程第4頁/共23頁第四頁，共24頁。病毒(bngd)的分離與培養(yǎng)主要有細(xì)胞主要有細(xì)胞(xbo)(xbo)培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動物接種法等培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動物接種法等, ,而對細(xì)而對細(xì)胞胞(xbo)(xbo)、雞胚不敏感、雞胚不敏感, ,又沒有合適動物模型的病毒又沒有合適動物模

3、型的病毒, ,可采用基因可采用基因克隆的方法。克隆的方法。02PART 第5頁/共23頁第五頁，共24頁。細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)瓶雞成纖維細(xì)胞 二倍體細(xì)胞株來源于正常人胎兒(ti r)組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等；原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞，原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)；傳代細(xì)胞來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程中變異的細(xì)胞。第6頁/共23頁第六頁，共24頁。雞胚培養(yǎng)(piyng) 雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法(fngf)，此方法(fngf)可用以進(jìn)行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。一般(

4、ybn)選用914d的雞胚優(yōu)點(diǎn):來源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細(xì)菌、對接種病毒不產(chǎn)生抗體及病毒較易增殖等 不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大，選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關(guān)鍵：尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種尿囊腔接種：常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng)第7頁/共23頁第七頁，共24頁。動物(dngw)接種常用的實驗動物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等；常用的接種途徑包括(boku)皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式；第8頁/共23頁第八頁，共24頁。病毒增殖(zngzh)的觀察病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指

5、標(biāo)(zhbio) 1細(xì)胞形態(tài)的改變 2紅細(xì)胞吸附 3細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變病毒數(shù)量及病毒感染性測定 1血凝試驗 2中和試驗 3空斑形成試驗 4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）紅細(xì)胞吸附(xf)包涵體細(xì)胞形態(tài)改變第9頁/共23頁第九頁，共24頁。光學(xué)(gungxu)顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查(jinch)及診斷 直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒） 、包涵(bo hn)體 狂犬病毒感染嗜酸性包涵(bo hn)體。掃描電子顯微鏡 用于觀察病毒和細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等 。透射電子顯微鏡 用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等。第10頁/共23頁第十頁，共24頁?？瞻咝纬?x

6、ngchng)試驗n是一種(y zhn)檢查和準(zhǔn)確測定病毒滴度的方法。n將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。n結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。n每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。n病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。第11頁/共23頁第十一頁，共24頁。免疫學(xué)方法(fngf)03P

7、ART 第12頁/共23頁第十二頁，共24頁。ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合(jih)在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。

8、由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。第13頁/共23頁第十三頁，共24頁。病毒核酸分子(fnz)檢測04PART 第14頁/共23頁第十四頁，共24頁?；蛐酒?j yn xn pin) 基因芯片(gene chip)又稱基因微矩陣(DNA microarry)具有微型化、高通量 、并行處理易于自動化等優(yōu)越性,它將大量的靶基因片段有序、高密度地排列在玻片、硅等載體上, 用熒光檢測后 , 通過計算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)(shj)比較和分析 ,一次試驗就可對上萬種基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確 、高效的檢測。第15頁/共23頁第十五頁，共24頁。實時(sh sh)熒光定量 P

9、CR 目前最有效、最靈敏的方法就是實時熒光定量 PCR（real time RT-PCR），根據(jù)目標(biāo)核酸基因來設(shè)計引物實現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測，已廣泛應(yīng)用在臨床樣品的檢測。real time RT-PCR 是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于 PCR 儀中，在PCR 的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用獲取(huq)的熒光信號積累來實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程，最終通過得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知得模板進(jìn)行定量分析的方法。第16頁/共23頁第十六頁，共24頁。新型(xnxng)核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)05PART 第17頁/共23頁第十七頁，共24頁。NASBA NASBA（Nuclear acid sequence-based am

10、plification，核酸依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù)）是一項以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實時觀測結(jié)果的檢測方法。該技術(shù)的檢測反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)(xn bio)探針共同協(xié)作而完成。 相對于免疫學(xué)方法或其他基因檢測法，NASBA速度快，特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測范圍廣泛，缺點(diǎn)在于成本較高。第18頁/共23頁第十八頁，共24頁。雜交(zjio)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)HCR 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization Chain Reaction, HCR）是由 Dirks 與 Pierce于 2004 年提出的一種高效的核酸擴(kuò)增方法

11、，根據(jù)核酸探針競爭性雜交形成長度不等的亞穩(wěn)態(tài)核酸雙鏈實現(xiàn)輸出信號的放大。HCR 反應(yīng)在室溫下即可，無需變溫調(diào)節(jié)、酶的輔助及其它試劑的參與，在核酸信號擴(kuò)增方面得到廣泛應(yīng)用。HCR 反應(yīng)體系由一段啟動探針 I，兩段發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)探針 H1、H2 構(gòu)成，H1 與 H2 發(fā)夾環(huán)探針結(jié)構(gòu)相似，分為(fn wi)環(huán)部、莖部以及粘性末端三個部分，啟動探針引發(fā)兩段功能性核酸探針競爭性結(jié)合，形成亞穩(wěn)態(tài)的核酸雙鏈，從而實現(xiàn) HCR 反應(yīng)。第19頁/共23頁第十九頁，共24頁。HCR 介導(dǎo)的比色方法(fngf) 比色法主要通過顏色的變化來實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。 將 HCR 反應(yīng)(fnyng)與形成G-四連體結(jié)構(gòu)結(jié)合用于檢

12、測一段 TBV 寡核苷酸序列。HCR介導(dǎo)的熒光(ynggung)檢測方法 熒光因其特有的發(fā)光性質(zhì)，可通過儀器檢測熒光信號值的變化實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的實時監(jiān)測，結(jié)合 HCR 信號擴(kuò)增技術(shù)后會將信號放大輸出，實現(xiàn)更加靈敏的檢測?；?HCR 介導(dǎo)的核酸檢測方法HCR 介導(dǎo)的納米金方法 當(dāng)靶標(biāo)與兩段探針通過 HCR 反應(yīng)結(jié)合不斷形成核酸雙鏈結(jié)構(gòu)，核酸探針就會從納米金上脫落下來，使得納米金在鹽溶液中發(fā)生聚集，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。通過肉眼觀測到溶液顏色的變化，實現(xiàn)了核酸可視化的檢測。 HCR 反應(yīng)與電化學(xué)方法相結(jié)合 發(fā)夾環(huán)核酸探針固定在電極上，通過與待檢靶標(biāo)以及核酸引物堿基互補(bǔ)后，在 dNTP 與聚合酶作用下，循

13、環(huán)形成多個帶有可啟動 HCR 序列的引物，與標(biāo)記Biotin的 H1、H2 進(jìn)行 HCR 反應(yīng)，特異性與標(biāo)記 SA 的堿性磷酸化酶在電極上產(chǎn)生電信號，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測。第20頁/共23頁第二十頁，共24頁。自動化高通量可視化集約化規(guī)模化 病毒檢測技術(shù)中核酸檢測可直接對病毒基因進(jìn)行檢測，避免抗原和抗體檢測的窗口期漏檢，而且基本上可以檢測微量病毒基因，這是抗原和抗體檢測試劑不能比擬的。同時病毒檢測技術(shù)正趨向大型化、集約化、規(guī)模化、自動化、高通量篩選，一次獲得(hud)多個相關(guān)病原體信息，并能分析、鑒別所獲得(hud)的檢測結(jié)果。利用熒光實時PCR和NASBA同時檢測多種病毒或是未來發(fā)展的主要方向。展望(zhnwng)第21頁/共23頁第二十一頁，共24頁。THANKS第22頁/共23頁第二十二頁，共24頁。感謝您的觀看(gunkn)！第23頁/共23頁第二十三頁，共24頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)前言。病毒檢測