黑曲霉利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件研究.doc

1、黑曲霉 B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件研究摘 要: 通過比較常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵， 研究黑曲霉 B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件.結(jié)果表明, 在生料發(fā)酵過程中， 采用20%五倍子并且以（NH4)2SO4為氮源制備單寧酶的最佳條件為： 液固比=1。6：1、溫度 30°C、初始 pH 6。0.在該條件下通過 96 h 的培養(yǎng)， 單寧酶的活力可達(dá) 51.2 U/gds， 是常規(guī)滅菌發(fā)酵的 3.6 倍。以上結(jié)果顯示， 生料發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶是一種高效可行的方法。關(guān)鍵詞: 黑曲霉， 單寧酶， 生料發(fā)酵， 五倍子, 固體發(fā)酵Research on Conditions o

2、f Tannase Production fromAspergillus Niger B0201 Under SolidstateFermentation Using GallnutLI YangZhen1，2QIU ShuYi1,2BAO YuXin1，3Wu XinYing1,2（1。 Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy， Guiyang, Guizhou 550003， China）(2。 Chemical Engineering College of Guizhou Un

3、iversity， Guiyang, Guizhou 550003， China)(3. Life Science College of Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550000, China）Abstract： According to the comparative research of conventional sterile fermentation and uncooked materialfermentation, the conditions of tannase production from Aspergillus Niger

4、B0201 under solidstate fermentation using gallnut was studied. The results showed that the liquidsolid ratio of 1.6: 1, temperature of 30°C,initial pH of 6.0 were the optimal conditions for tannase production under uncooked material fermentationwith gallnut content of 20% and （NH4）2SO4for nitro

5、gen sources. Under this condition， tannase activityreached to 51。2 U/gds after 96 h of cultivation， which was 3。6 times as the conventional sterile fermentation。The results above revealed that under uncooked material fermentation for tannase production was a feasiblemethod with high efficiency。Keywo

6、rds： Aspergillus niger， Tannase， Uncooked material fermentation， Gallnut, Solidstate fermentation1124 微生物學(xué)通報(bào) 2009, Vol.36， No.8http：/journals。單寧酶, 可水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵， 生成沒食子酸和葡萄糖1。單寧酶可應(yīng)用于制革、釀酒、醫(yī)藥、飲料等領(lǐng)域， 具有廣闊的應(yīng)用前景。但是目前生產(chǎn)單寧酶的效率不高， 市場(chǎng)價(jià)格昂貴, 阻礙了單寧酶的應(yīng)用。單寧酶是一種誘導(dǎo)酶， 主要利用微生物發(fā)酵生產(chǎn).目前國(guó)內(nèi)主要采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)單寧酶2，3， 而國(guó)外近期的研究主

7、要集中在固體發(fā)酵法46.很多資料79顯示固體發(fā)酵主要產(chǎn)胞外單寧酶， 容易提取， 穩(wěn)定性好， 雜酶少, 且設(shè)備比較簡(jiǎn)單， 同時(shí)固體發(fā)酵有利于提高產(chǎn)酶活力。本實(shí)驗(yàn)室篩選出的黑曲霉 B0201 菌株能利用中國(guó)特產(chǎn)五倍子作為誘導(dǎo)物固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶。但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)原料五倍子在高壓蒸汽滅菌時(shí)很容易焦化， 變成褐色, 粘稠。高溫破壞了五倍子的結(jié)構(gòu)， 對(duì)黑曲霉菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生危害, 嚴(yán)重影響單寧酶的產(chǎn)量.尤其當(dāng)培養(yǎng)基中五倍中含量較大時(shí)， 高溫對(duì)培養(yǎng)基的破壞更明顯, 黑曲霉菌株完全不能生長(zhǎng)。為解決這個(gè)問題, 本文采用生料固體發(fā)酵的方法生產(chǎn)單寧酶。有資料10顯示五倍子具有抗菌消炎作用, 五倍子粉、五倍子浸液等體

8、外實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌以及傷寒、副傷寒、痢疾、炭疽、白喉、綠膿桿菌等均有明顯的抑菌或殺菌作用, 而且固體發(fā)酵過程中固態(tài)培養(yǎng)基水活度低， 能降低染菌概率11, 所以生料固體發(fā)酵在理論上是可行的。本文比較了常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵對(duì)黑曲霉利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的影響， 對(duì)發(fā)酵過程中的參數(shù)進(jìn)行了比較研究， 發(fā)現(xiàn)了生料發(fā)酵的優(yōu)勢(shì), 并優(yōu)化了生料發(fā)酵的產(chǎn)酶條件, 得到一種高效可行的產(chǎn)單寧酶的方法.1 材料與方法1。1 材料1.1.1 菌種： 黑曲霉 B0201（Aspergillus niger)， 由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紫外誘變?cè)己谇咕旰Y選出來， 菌種在 4&

9、#176;C 條件下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上。1。1。2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 : 稱取五倍子粉和麩皮共5.0 g 裝入 250 mL 的三角瓶作為培養(yǎng)基基礎(chǔ), 其中五倍子含量為 8, 加入 1% （W/W) NH4NO3， 0.1（W/W) MgSO4·7H2O, 0。1 （W/W) NaCl, 5 mL 蒸餾水，攪拌均勻.1。1.3 主要儀器與設(shè)備： UV2550 紫外可見分光光度計(jì), 恒溫培養(yǎng)箱。1。1。4 主要試劑： 沒食子酸丙酯購(gòu)于湖南省張家界貿(mào)源化工有限公司, 繞單寧由上海君創(chuàng)化工有限公司生產(chǎn)， 五倍子產(chǎn)于貴州省遵義市余慶縣， 試劑均為化學(xué)純。1。2 方法1.2。1

10、固體發(fā)酵方法: 1） 常規(guī)滅菌發(fā)酵.基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配好后, 于 1×105Pa 高壓蒸汽滅菌 20 min,冷卻后在 5 g 培養(yǎng)基中接種 1 mL 黑曲霉 B0201 孢子懸液(1×108個(gè)孢子/mL), 混勻后置于 30°C 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 96 h.2） 生料發(fā)酵?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配好后， 不經(jīng)高壓蒸汽滅菌, 直接在 5 g 培養(yǎng)基中接種 1 mL 黑曲霉B0201 孢子懸液 (1×108個(gè)孢子/mL）， 混勻后置于30°C 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 96 h。1。2.2 粗酶液提取: 取出培養(yǎng) 96 h 的三角瓶， 在三角瓶中加入 100 mL

11、 pH 5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液, 30°C條件下 150 r/min振蕩浸提 1 h， 用定性濾紙過濾即得粗酶液。1。2。3 酶活檢測(cè)方法： 根據(jù)文獻(xiàn)12的方法測(cè)定單寧酶活力。單寧酶在 pH 5.0、30°C 條件下每分鐘產(chǎn)生 1 mol沒食子酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）.1.2。4 常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵的比較： 比較常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵對(duì)培養(yǎng)基和菌株生長(zhǎng)的影響及對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響。并優(yōu)化在 2 種發(fā)酵條件下五倍子含量（435%)， 初始加水量（液固比 0。6: 12：1）對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響。所有發(fā)酵都作 3 個(gè)平行。1.2。5 五倍子生料發(fā)酵條件優(yōu)化：

12、在五倍子生料發(fā)酵的培養(yǎng)條件下, 優(yōu)化各個(gè)培養(yǎng)參數(shù)， 采用不同的培養(yǎng)溫度(25°C40°C), 不同的接種量(0.1 mL2.5 mL), 改變培養(yǎng)初始 pH 值(38), 除誘導(dǎo)物之外添加額外碳源（葡萄糖， 淀粉， 玉米粉）, 選取不同氮源（NH4Cl、NaNO3、（NH4）2SO4、黃豆粉、蛋白胨、尿素)取代 NH4NO3, 添加不同的磷酸鹽和鈣鹽， 考察對(duì)該菌產(chǎn)酶的影響.所有發(fā)酵都作 3 個(gè)平行。1.2.6 兩種發(fā)酵條件下產(chǎn)單寧酶的時(shí)間曲線： 在常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上將該菌株培養(yǎng)（0168 h）, 研究單寧酶活力隨時(shí)間的變化情況, 比較產(chǎn)單寧酶活力。所

13、有發(fā)酵都作 3 個(gè)平行。李秧針等： 黑曲霉 B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件研究 1125http:/journals.im。2 結(jié)果與討論2。1 兩種發(fā)酵方法對(duì)培養(yǎng)基和菌株生長(zhǎng)的影響改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中五倍子含量， 分別按常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶, 兩種發(fā)酵方法對(duì)培養(yǎng)基性質(zhì)和菌株生長(zhǎng)的影響見表 1。從表中可以看出培養(yǎng)基中五倍子經(jīng)高溫滅菌容易焦化， 變性，對(duì)黑曲霉菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生危害, 在高濃度時(shí)導(dǎo)致黑曲霉不能生長(zhǎng)。而未經(jīng)高溫滅菌時(shí)培養(yǎng)基沒被破環(huán),黑曲霉生長(zhǎng)旺盛， 且無雜菌的生長(zhǎng)痕跡.這說明了以中國(guó)特產(chǎn)五倍子為誘導(dǎo)物生產(chǎn)單寧酶時(shí)生料發(fā)酵更適合于黑曲霉生長(zhǎng).表 1 常規(guī)滅菌發(fā)酵

14、和生料發(fā)酵對(duì)培養(yǎng)基和菌株生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of conventional sterile fermentationand uncooked material fermentation to mediumand growth of strains五倍子含量Content ofgallnut常規(guī)滅菌發(fā)酵Conventional sterilefermentation生料發(fā)酵Uncooked materialfermentation8%培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后有少量焦化顆粒；培養(yǎng) 96 h 后黑曲霉生長(zhǎng)旺盛培養(yǎng)基無焦化無破壞； 黑曲霉生長(zhǎng)旺盛, 無雜菌生長(zhǎng)25%培養(yǎng)基部分焦化； 黑曲

15、霉生長(zhǎng)較好同上50培養(yǎng)基焦化嚴(yán)重; 黑曲霉部分生長(zhǎng)同上75%培養(yǎng)基完全焦化， 粘稠； 無黑曲霉生長(zhǎng)同上100培養(yǎng)基完全焦化， 粘稠； 無黑曲霉生長(zhǎng)有點(diǎn)粘稠， 黑曲霉生長(zhǎng)較好2.2 兩種發(fā)酵方法對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物五倍子含量為 8%,分別按常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶, 兩種發(fā)酵方法產(chǎn)單寧酶的活力如表 2。從表中可以看出, 采用生料發(fā)酵， 單寧酶活力從常規(guī)滅菌發(fā)酵的14。0 U/gds (Gram dry substrate 每克培養(yǎng)基干重)提高到了 18.2 U/gds。采用生料發(fā)酵新方法生產(chǎn)單寧酶,培養(yǎng)基中無雜菌生長(zhǎng)， 單寧酶活力有了較大的提高，而且簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程, 說

16、明黑曲霉 B0201 利用五倍子生料發(fā)酵產(chǎn)單寧酶在實(shí)踐上也是可行的， 比常規(guī)滅菌發(fā)酵優(yōu)越。表 2 兩種發(fā)酵方法對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Table 2 Effect of the two methods to produce tannase發(fā)酵方法Methods of fermentation酶活（U/gds）Enzyme activity (U/gds）常規(guī)滅菌發(fā)酵Conventional sterile fermentation14。0生料發(fā)酵Uncooked material fermentation18。22.3 兩種發(fā)酵方法下五倍子含量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中五倍子含量， 分別按常

17、規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶, 兩種發(fā)酵方法下產(chǎn)單寧酶的活力如圖 1 所示。圖 1a 中采用常規(guī)滅菌發(fā)酵， 當(dāng)五倍子含量為 8時(shí)單寧酶活力最高， 為14。0 U/gds。隨著五倍子含量的增加酶活力反而下降，究其原因可能是由于隨著五倍子含量的增加, pH 值減小, 培養(yǎng)基中 pH 值減少影響單寧酶的產(chǎn)生, 另一個(gè)原因是五倍子含量較大時(shí)， 高壓蒸汽滅菌對(duì)五倍子的破壞程度越重, 對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響也越大， 這圖 1 常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵時(shí)五倍子用量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig。 1 Effect of gallnut content on production of tannase under conv

18、entional sterile fermentationand uncooked material fermentation注： a： 常規(guī)滅菌發(fā)酵; b: 生料發(fā)酵.Note: a： Conventional sterile fermentation; b: Uncooked material fermentation。1126 微生物學(xué)通報(bào) 2009, Vol.36, No.8/wswxtbcn圖 2 常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵時(shí)加水量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig. 2 Effect of initial moisture content on pro

19、duction of tannase under conventional sterile fermentationand uncooked material fermentation注： a: 常規(guī)滅菌發(fā)酵; b: 生料發(fā)酵。Note: a: Conventional sterile fermentation; b： Uncooked material fermentation.點(diǎn)可以通過生料發(fā)酵新方法避免.圖 1b 中采用生料發(fā)酵， 當(dāng)五倍子添加量為 20時(shí)酶活力最高， 為25。0 U/gds， 是滅菌條件的 1。8 倍.2。4 兩種發(fā)酵方法下初始加水量對(duì)產(chǎn)酶的影響常規(guī)滅菌發(fā)酵基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)

20、基中五倍子含量為8%， 生料發(fā)酵五倍子含量為 20， 改變初始加水量,兩種發(fā)酵方法下產(chǎn)單寧酶的活力如圖 2 所示。圖 2a中采用常規(guī)滅菌發(fā)酵， 當(dāng)液固比為 1:1 時(shí)單寧酶的活力最高， 為 14。0 U/gds。當(dāng)加水量增大時(shí), 酶活下降。五倍子滅菌時(shí)容易焦化, 生成褐色膠狀物質(zhì), 容易使培養(yǎng)基粘成一團(tuán), 所以當(dāng)水分含量太大時(shí), 培養(yǎng)基成團(tuán)現(xiàn)象很嚴(yán)重, 不利于培養(yǎng)基中的菌株吸取氧份， 從而降低了酶活.圖 2b 中采用生料發(fā)酵， 當(dāng)液固比為 1.6:1 時(shí)單寧酶活力最高， 為 38。3 U/gds。這是因?yàn)樯习l(fā)酵時(shí)五倍子不會(huì)焦化, 可很好的避免滅菌時(shí)因水分含量大易成團(tuán)的現(xiàn)象， 最適液固比由 1

21、:1 變成了 1。6:1。充足的加水量彌補(bǔ)了固體發(fā)酵過程中水分的損失，促進(jìn)了單寧酶生成。從圖中可以看出液固比在1。6:12：1 的范圍內(nèi)單寧酶活力相當(dāng)， 說明生產(chǎn)過程應(yīng)保證濕度足夠大， 可以在培養(yǎng)過程中適度噴水，保證固體發(fā)酵所需的水分。2。5 培養(yǎng)溫度對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在優(yōu)化的五倍子含量和加水量條件下， 生料發(fā)酵產(chǎn)單寧酶中培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 3 所示.培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶有較大影響, 當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到 30°C時(shí)， 酶活力最高, 達(dá)到 38。8 U/gds。培養(yǎng)過程觀察發(fā)現(xiàn)， 溫度太低黑曲霉生長(zhǎng)緩慢， 孢子不成熟; 30°C圖 3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig。 3 Effe

22、ct of incubation temperature on enzymeproduction33°C 是最適產(chǎn)酶溫度， 黑曲霉生長(zhǎng)旺盛, 孢子成熟,且無雜菌生長(zhǎng)； 37°C40°C 黑曲霉生長(zhǎng)較好， 孢子成熟, 但可以看到有少量雜菌生長(zhǎng).所以控制在合適的溫度范圍內(nèi), 能抑制培養(yǎng)基中雜菌的生長(zhǎng)， 提高單寧酶的活力.2。6 裝量對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在 250 mL 三角瓶中分別裝培養(yǎng)基 3 g、5 g、7 g、10 g、15 g 和 18 g， 按比例接種后置于 30°C 下培養(yǎng),由于料層太厚, 培養(yǎng) 2 d 后翻樣并噴水， 培養(yǎng) 4 d 后測(cè)定培養(yǎng)基中

23、單寧酶的活力。由圖 4 的結(jié)果可以看出, 裝量對(duì)五倍子生料發(fā)酵產(chǎn)單寧酶有很顯著的影響， 裝量越少越有利于黑曲霉單寧酶的合成。這主要和培養(yǎng)基的氧的供應(yīng)以及與培養(yǎng)基內(nèi)部溫度有關(guān)。對(duì)于黑曲霉來說， 充足的供氧有利于單寧酶的李秧針等： 黑曲霉 B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件研究 1127/wswxtbcn圖 4 裝量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig。 4 Effect of different medium contents on enzymeproduction合成; 而少的裝量則有利于培養(yǎng)基內(nèi)部熱量的散發(fā),防止溫度過高而導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不良以及影響產(chǎn)酶。但

24、裝量太小， 增大了固體發(fā)酵的面積， 不利于生產(chǎn)成本的降低。在生產(chǎn)過程中可以加強(qiáng)通風(fēng)和補(bǔ)水.本實(shí)驗(yàn)仍然選裝量在 5 g。2.7 接種量對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響用蒸餾水把 PDA 斜面上的黑曲霉孢子洗下來制成濃度為 1×108個(gè)/mL 的黑曲霉孢子懸液, 在 5 g培養(yǎng)基中分別加入 0。1 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL 和 2。5 mL 孢子懸液.由圖 5 可以看出, 接種1 mL 黑曲霉孢子懸液時(shí)酶活力最高, 為 42.7 U/gds。加入孢子懸液較多時(shí)， 菌絲生長(zhǎng)較快, 可能是代謝產(chǎn)物積累過多, 反而會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng).接種量太小, 菌絲生長(zhǎng)緩慢， 延長(zhǎng)了生長(zhǎng)周

25、期.實(shí)驗(yàn)過程無雜菌生長(zhǎng)。當(dāng)稀釋黑曲霉孢子懸液到一定倍數(shù), 1×106個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL 和 1×104個(gè)/mL, 各取 1 mL接種培養(yǎng), 4 d 后觀察發(fā)現(xiàn) 1×106個(gè)/mL 的培養(yǎng)基中有少量雜菌的生長(zhǎng), 1×105個(gè)/mL 培養(yǎng)基中有較多雜菌的生長(zhǎng), 1×104個(gè)/mL 培養(yǎng)基中有大量雜菌的生長(zhǎng), 和黑曲霉長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)； 測(cè)酶活， 分別為24.9 U/gds, 19.3 U/gds 和 16.8 U/gds。通過菌株形態(tài)觀察這些雜菌是青霉和根霉。所以控制接種量在合適的范圍， 能減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。2.8 初始 pH 對(duì)生料

26、發(fā)酵產(chǎn)酶的影響分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始 pH 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7。0、8.0 和自然（pH=5。2), 接入孢子懸液 1 mL，30°C 培養(yǎng) 96 h, 提取粗酶液， 測(cè)酶活力.結(jié)果見圖 6,圖 5 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig。 5 Effect of inoculation amount on enzyme production圖 6 初始 pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig。 6 Effect of initial medium pH on enzyme production以初始 pH 為 6 的培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力最高， pH 57 是較適合產(chǎn)酶的初始 pH.2。9 額外添加

27、碳源對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在誘導(dǎo)物五倍子作為碳源的情況下額外添加不同碳源, 分別為 1葡萄糖、1淀粉、1玉米粉， 對(duì)產(chǎn)酶情況進(jìn)行研究, 每隔 24 h 測(cè)一次酶活, 得到產(chǎn)酶曲線如圖 7 所示, 從圖中可看出額外添加碳源,單寧酶活力隨時(shí)間發(fā)生了變化， 但對(duì)產(chǎn)酶提高作用不明顯。碳源添加量的研究表明隨著量的增加產(chǎn)酶反而受到抑制, 這是因?yàn)槲灞蹲拥囊粋€(gè)單寧分子附有一個(gè)葡萄糖分子， 單寧酶水解五倍子單寧所生成的葡萄糖完全可以作為碳源， 供微生物生長(zhǎng)繁殖。葡萄糖與麩皮中的碳源能夠滿足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的需要, 過多的碳源雖對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用， 但不利于產(chǎn)酶, 因此在后續(xù)試驗(yàn)中培養(yǎng)基都不額外添加碳源.1128

28、 微生物學(xué)通報(bào) 2009, Vol。36， No。8http:/journals。圖 7 額外碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig。 7 Effect of additional carbon sources on enzymeproduction2。10 不同氮源對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響分別在培養(yǎng)基中添加 1的不同氮源， NH4Cl、NaNO3、（NH4)2SO4、黃豆粉、蛋白胨、尿素， 取代NH4NO3， 對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響如圖 6 所示。其中（NH4）2SO4的產(chǎn)酶情況最理想， NH4Cl， 尿素也比NH4NO3有所提高。選用(NH4）2SO4作為氮源.進(jìn)一步研究了氮源添加量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響, 實(shí)驗(yàn)證明隨著

29、（NH4)2SO4添加量的增加, 酶活力沒有提高。2.11 磷酸鹽和鈣鹽對(duì)生料發(fā)酵產(chǎn)酶的影響有資料顯示13磷酸鹽和鈣鹽的添加能促進(jìn)酸性蛋白酶的生成， 本實(shí)驗(yàn)研究了在培養(yǎng)基中額外添加圖 8 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig. 8 Effect of different nitrogen sources on enzyme production注: 1: NH4NO3; 2： NH4Cl； 3： NaNO3； 4: （NH4）2SO4； 5： 黃豆粉;6: 蛋白胨; 7： 尿素。Note: 1: NH4NO3; 2: NH4Cl; 3: NaNO3; 4: （NH4）2SO4; 5: Soybeanfl

30、our； 6: Peptone; 7: Carbamide。圖 9 磷酸鹽和鈣鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig. 9 Effect of additional phosphate and calcium on enzyme productionNote： 0： Control； 1: K2HPO4； 2： KH2PO4; 3： Na2HPO4; 4: NaH2PO4;5: CaCl2.0。5的磷酸鹽和鈣鹽對(duì)產(chǎn)生單寧酶的影響。從圖 9所示， KH2PO4, NaH2PO4能稍微提高單寧酶的酶活。選取 KH2PO4, 作不同濃度, 0。5、1和 1.5%酶活分別為 40。7 U/gds、43.4 U/gds

31、和 41.3 U/gds, 1%時(shí)酶活力最高, 但考慮到磷酸鹽用量大, 提高效果不顯著, 培養(yǎng)過程不添加。2。12 兩種工藝產(chǎn)單寧酶的時(shí)間曲線綜合以上各項(xiàng)參數(shù), 采用優(yōu)化后的單因素對(duì)黑曲霉利用五倍子為誘導(dǎo)物進(jìn)行常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵 168 h, 每隔 24 h 取樣一次檢測(cè)單寧酶活性, 時(shí)間曲線如圖 10 所示。生料發(fā)酵以 5 g 五倍子和麩皮的混合物作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 其中五倍子含量為 20%,液固比為 1.6：1， 加入 1% (NH4）2SO4氮源, 接種量1 mL， 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 6。0， 由圖可見酶活力的最高點(diǎn)出現(xiàn)在 96 h, 為 51.2 U/gds， 72 h 時(shí)酶活力基本

32、接近最高點(diǎn)。常規(guī)滅菌發(fā)酵, 五倍子含量為 8， 液固比為 1:1， 96 h 時(shí)單寧酶活力最高為 14 U/gds。A.Sabu4用兩種富含單寧酸的農(nóng)作物廢棄物 Tamarindseed powder 和 Palm kernel cake 由黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶, 最高酶活分別為6。44 U/gds和13.3 U/gds。本文也驗(yàn)證了常規(guī)滅菌發(fā)酵下得出的酶活力為14 U/gds, 水平與之相當(dāng)， 但采用生料發(fā)酵時(shí)酶活力有了大幅度的提高, 是常規(guī)滅菌發(fā)酵時(shí)的 3.6 倍。通過比較可以看出, 五倍子生料發(fā)酵跟常規(guī)滅菌發(fā)酵相比， 不僅大幅度的提高了單寧酶的酶活， 減少了工藝流程, 而且縮短了發(fā)酵

33、周期。李秧針等： 黑曲霉 B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件研究 1129/wswxtbcn圖 10 產(chǎn)單寧酶的時(shí)間曲線Fig。 10 The time curves of producing tannase注: 1: 常規(guī)滅菌發(fā)酵； 2: 生料發(fā)酵.Note： 1： Conventional sterile fermentation； 2： Uncooked materialfermentation.3 結(jié)論本文比較了常規(guī)滅菌發(fā)酵和生料發(fā)酵對(duì)黑曲霉B0201 利用五倍子固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的影響。通過對(duì)發(fā)酵過程中的參數(shù)進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn), 證明五

34、倍子生料發(fā)酵更適合單寧酶的生產(chǎn)。并優(yōu)化了黑曲霉B0201 利用五倍子生料固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵條件.單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明： 液固比為 1.6： 1， 溫度為 30°C 時(shí)， 接種量為 1 mL, pH 6。0 為最佳產(chǎn)酶條件;并對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化， 五倍子用量為 20%,額外添加碳源, 磷酸鹽和鈣鹽等均不能提高單寧酶產(chǎn)量， 最好的氮源是(NH4）2SO4。在優(yōu)化的條件下，培養(yǎng) 96 h 后產(chǎn)單寧酶酶活力達(dá)到了 51.2 U/gds， 是常規(guī)滅菌發(fā)酵的 3.6 倍。中國(guó)特產(chǎn)五倍子具有自身的特性， 高溫處理易焦化， 嚴(yán)重影響黑曲霉的生長(zhǎng)。本文創(chuàng)新的采用了生料發(fā)酵新方法， 即黑曲霉利用

35、五倍子生料固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的方法， 該方法適應(yīng)了五倍子的特性，大幅度的提高了產(chǎn)單寧酶的水平， 且簡(jiǎn)化了設(shè)備和生產(chǎn)流程, 為單寧酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供了一種高效可行的方法。五倍子生料發(fā)酵的方法運(yùn)用于生產(chǎn)， 可大幅度降低生產(chǎn)成本， 產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)效益, 具有重要的研究意義和很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。參 考 文 獻(xiàn)1 Kenji Aoki， Ryu Shlnke， Hiroshi Nishira。 Purification andsome properties of yeast tannaseAgri Biol Chem, 1976,40(1）: 7985.2 劉如石, 謝達(dá)平, 李清明， 等。 Asp. nige

36、r No。3 液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶條件的研究。 食品科學(xué), 2001， 22（2）: 2832.3 游見明. 黑曲霉單寧酶發(fā)酵工藝. 現(xiàn)代食品科技, 2005，21（3): 9698.4 A Sabu, A Pandey, M Jaafar Daud， et al. Tamarind seedpowder and palm kernel cake： two novel agro residues forthe production of tannase under solid state fermentationby Aspergillus niger ATCC 16620. Bioresource Technology， 2005， 96(11): 12231228.5 Rakesh Kumar, Jitender Sharma, Randhir Singh. Produc-ti