重組TaqDNA聚合酶的表達(dá)和純化鑒定

1、重組taqdna聚合酶的表達(dá)和純化鑒定24 (5) : 124126江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2012,act aagriculturaejiangxi垂組taqdna聚合酶的表達(dá)和純化鑒定劉欽松，劉孟剛，張從從，張程，許彤(山東博奧克生物科技有限公司，山東聊城252000)摘【h的】?！痉椒ā克＃罕磉_(dá)、純化taqdna聚合酶，并檢測(cè)其擴(kuò)增性能活化含 taqdna聚介酶基因的菌株jm109,iptg誘導(dǎo)表達(dá)。h的蛋白利用akta蛋白純化系統(tǒng)，ileparinsepharosefastflow, q sepha-依次過(guò) affi gelbluesepharose, rosefastflow,。【結(jié)果】經(jīng) sd

2、s page 分析， 以國(guó)外進(jìn)口 taq酶為標(biāo)準(zhǔn)，采用對(duì)比法初略測(cè)定酶活性，驗(yàn)證產(chǎn)品質(zhì)量制備的tdqdwa聚 合酶具有擴(kuò)增效率高、。【結(jié)論】純度高、特異性強(qiáng)、無(wú)核酸酶污染、活性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成 功表達(dá)純化taqdna聚合酶，其擴(kuò)增性能達(dá)到菇至超過(guò)國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品。關(guān)鍵詞:taqdna聚合酶；純化;擴(kuò)增性能中圖分類(lèi)號(hào):q814. 1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào):1001-8581 (2012) 05-0124-03expression, purificationandidentificationofrecombinanttaqdnapolyine:raseliuqinsong, liumeng gang, z

3、ilaxgcong cong, zhangcheng, xutong(shandongboaokobiotechnologylimitodcompany, liaochong252000, china)abstract： inordortocxpressandpurifytaqdnapolymoraso, anddetectitsamplificationpetfornumce,e. colistrainjm109containingthegeneoftaqdnapolymerasewasactivated, andthegenewasexpressedunderthe inducemenlo

4、fiptg. theexpressedhcparinsepharoscfastflowandprotcinwaspur i f i edbyaktapro te i npurificationsystem throughpassingaffigolbluosopharose,qsopharosefastflowinturn. takingtaqonzymcimportcdfroniabtoadqsthcstandatd, theenzymeactivitywasroughlydeter- andtheproductqualitywasverifiedfinally. theresuitsrev

5、ealedthatthepreparedmined throughant i thesesandsds pageanalysis,taqdnapolymerasehadthefollowinggoodcharacteristies：hi ghamplificat ionefficiency, highpuri ty, strongspecificity,nonucleasepollutionandstableactivity. inconclusion,thercconibinanttaqdnapolymorasewassuccessfullyexpressedandpurifiod, and

6、itsamplificationperfonnancecould:reachorexceedthatofthesimilarproductsimport edfromabroad.keywords： taqdnapolymerase； purification； amplificationperformancemullis 等1 1985 年提出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasepcr）, 1988 年 saiki 等2 從溫泉的細(xì)菌chainreaction,thermusaquaticus中提収出耐熱t(yī)aqdna聚合酶，分子量為94kda,由832個(gè)氨基酸殘 基組成，熱穩(wěn)定性好，在758

7、ctc條件下每個(gè)酶分子每秒鐘可聚合約150個(gè)核昔酸，在 pcr實(shí)驗(yàn)中起著重要作用，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域2 4公司）,高速冷凍離心機(jī)（cr21ght, h本h立），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（jy92 iid,寧 波新芝），凝膠成像儀（biodoc it 體機(jī)，pcr儀（tc512,上海思們明），英國(guó) techne） o氨節(jié)青霉素（ampicillin）抗生素購(gòu)自amresco公yeastextrant購(gòu)自oxotd公司， affi gel 司；tryptoneheparinsepharosefastflo qsepha-bluesepharose、rosefastflow購(gòu)自ge公司;異丙基一

8、 b _d一硫代毗喃半乳糖昔（iptg）、聚乙烯亞胺 （pei）、硫酸錢(qián)（nh4） 2s04）、乙基苯基聚乙二醇（np40）、二硫蘇糖吐溫 （tween）均購(gòu)自sigma公司，其他試劑醇（dtt）、均為分析純。1. 3taqdna聚合酶的表達(dá)配制lb培養(yǎng)基4l,滅0. 1%活化，180r/min, 37菌，備用；取40mllb培養(yǎng)基，°c過(guò)夜培養(yǎng)；第2天進(jìn)行1% 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)4l,待菌液0d為0. 60. 8時(shí)，加入iptg （終濃度0. lmmol/l）,誘離 心收集菌體，去上淸，稱(chēng)重20g,備用。導(dǎo)5h, 1. 4taqdna聚介酶純化前處理用100ml的懸浮100mmol/lt

9、ris-iicl (pii8. 0) , 0. lmmol/ledta,液taqdna聚合酶由于thermusaquaticus培養(yǎng)因難,產(chǎn)量較低，雖然制備taqdna聚合酶的方法較多，但簡(jiǎn)便方法生產(chǎn)的酶制劑比活性不 高，并11質(zhì)量上無(wú)法和國(guó)外進(jìn)口 taqdnapolymerase相比，根本無(wú)法滿足人們對(duì)高質(zhì)量 taqdna聚合酶的需求5。木研究利用基因工把含有 thermusaquat icusdnapo 1 ymerase 程重組技術(shù),基因的菌株成功發(fā)酵誘導(dǎo)，利用世界上先進(jìn)的蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，得出高質(zhì)量的 taqdna聚合酶。11. 11. 2材料與方法菌種含taqdna聚合酶基因的j

10、m109菌株取口主耍器材ge蛋門(mén)純化系統(tǒng)(aktapurifieri0,山東博奧克生物科技有限公司研發(fā)中心菌種室。)5期劉欽松等：重組taqdna聚介酶的表達(dá)和純化鑒定1250. lmmol/ldtt, 10%甘油于冰上重懸沉淀,超聲波細(xì)12000r/胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞,然 后75°c熱處理30min, min, 4°c離心20min,棄沉淀上清備用;于冰上慢慢加入5%的 pei2. 7ml, 12000r/min, 4°c離并攪拌40min, 12000心,取上清,并緩慢加入30g(nii4) 2s04,攪拌 lh, 4°c離心；沉淀用 30ml 含有

11、50mmol/lnacl 的 r/min,tedg 溶液 e50mmol/ltris-hcl (pii8. 0)、0. 5mmol/ledta、0. lmmol/ldtt、10%甘 油溶解。1. 5taqdna聚合酶純化聚合酶依次過(guò)affigelbluesepharose> iieparinsepharosefastflov qsepha-rosefastflow,期間分別用下 個(gè)膠的平衡溶液透析 12h, 50mmol/ltrishc1 (ph 最后用 taqstoragebuffer 0. lmmol/ledta、 0. lmmol/ldtt 50mmol/l8. 0)、kck 0.

12、 5%np40、1%吐溫、50%甘油透析，一70°c保存。1. 6taqdna聚合酶的驗(yàn)證分別對(duì)taqdna聚介酶進(jìn)行活性以及核酸酶污染的測(cè)足。情況，結(jié)果如圖3所示，加入本酶反應(yīng)后，x dna/hindhi沒(méi)冇發(fā)牛彌散且亮度沒(méi)冇明顯 變化，因此，本制品未發(fā)現(xiàn)核酸外切酶污染。1： 50u上樣量；2： 25u上樣量；3： 5u上樣量；4： 2. 5u上樣量；m： proteinmarker圖2taqdna聚合酶不同上樣量sds-page電泳結(jié)果22. 1結(jié)果taqdna聚合酶活性的測(cè)泄利用分離純化的重組taqdna聚合酶與國(guó)外進(jìn)口的taqdna聚合酶同活1%力同時(shí)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖

13、1 所示(上樣5 p l, agarosegel),本研究制備的taqdna聚合酶與國(guó)外進(jìn)都可擴(kuò)增目的 dna片段，口 dna聚介酶有相似的活性，亮度基本一致1： x -dna/hindiii （陰性對(duì)照）；2、3： x -dna/hindiii外切酶污染驗(yàn)證產(chǎn)物圖3核酸外切酶污染檢測(cè)結(jié)果2. 4核酸內(nèi)切酶檢測(cè)10u的木酶和1 u g超螺旋質(zhì)粒45、70°c分別反應(yīng)4h,在22、觀察dna電泳譜帶變化情況，結(jié)果如圖4所示，加入本 酶反應(yīng)后，超螺旋質(zhì)粒沒(méi)有故本制品未發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶污染。出現(xiàn)降解彌散，2. 5m： dl5000dnamarker； 1> 3、5、7：國(guó)外a公司進(jìn)口

14、taq酶pcr產(chǎn)物（陰性對(duì)照、 0. 5u、1u、2u） ； 2、4、6、8：生產(chǎn) taq 酶的 pcr 產(chǎn)物（陰性 0. 5u、1u、2u）對(duì)照、taq dna聚介酶的穩(wěn)足性配制本酶并分別放到-20°c保存，不同的管中,每5d取出1支放到室溫（25°c）條件下,30d后進(jìn)行pcr, 50ulpcr體系中均加入2u本酶，查看條帶亮度變化情況，如圖5,室溫放置30dtaq酶仍 具有較高活力，后，基木沒(méi)有變化。圖itaqdna聚合酶pcr擴(kuò)增效率電泳圖2. 2taqdna聚合酶純度檢測(cè)sds-page電泳檢3討論利用大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)目的蛋口進(jìn)行表達(dá)，有其無(wú)法5、25、50u分別上

15、樣，測(cè)木制品純度，取木制品2. 5、電泳結(jié)果如圖2所示。用gel- proanalyzer軟件分析圖譜，結(jié)杲顯示純化生產(chǎn)的tagdna聚合酶無(wú)明顯雜帶，純度達(dá)到 95%以上。2.m123423mul/d分別反應(yīng)iii在觀察電泳譜帶變化優(yōu)點(diǎn)比擬的優(yōu)越性，例如培養(yǎng)周期短，表達(dá)水平高，成本低等6o taqdna聚合酶在分子生物學(xué)小應(yīng)用廣泛，有關(guān)taqdna聚合酶的制備技術(shù)也一直在不斷的優(yōu)化，主7 11 o、，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)24卷術(shù)，通過(guò)akta蛋白純化系統(tǒng)分離純化taqdna聚介酶，通過(guò)多次嚴(yán)格的驗(yàn)證，該dna聚 合酶具有活性穩(wěn)定、純度高、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、無(wú)核酸酶污染等優(yōu)點(diǎn)劑市場(chǎng)較為混亂，價(jià)格普

16、遍偏低，應(yīng)用akta蛋白純化系統(tǒng)雖然能得到高質(zhì)量的產(chǎn)品， 但是成本較高，利潤(rùn)空間較小，因此，以后應(yīng)加人純化替代品的研究，在保證產(chǎn)品質(zhì)降低 生產(chǎn)成本，達(dá)到雙贏的l1的。量的基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)：1 mulliskf, faloonaf, scharfs, etal. specificenzymaticampl ifi- coldcationofdnainvitro： thepolymerasechainreaction j 1986, 51(1)： 263 273. springharborsympquantbio1,2 saikirk, gelfanddh, stoffels, etal. pri

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18、11iamrusse1l molecularcloning： ala-m newyork： coldspringllarbolboratorymanual (volume3) 1、2：內(nèi)切酶污染驗(yàn)證產(chǎn)物；3： lug超螺旋質(zhì)粒(陰性對(duì)照)；m： dl5000dnamarker2001: 699 701. laboratorypress,5 肖朝文,j 杜娟,李晚忱.taqdna聚合酶制備技術(shù)的優(yōu)化2004, 22 (4) : 318-321.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),6 謝偉，樂(lè)超銀，王健，等.重組人粒細(xì)胞集落刺激兇子在人腸桿中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008, 12菌中的表達(dá)j (46) : 91

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