多糖檢測(cè)方法

1、多糖的檢測(cè)方法關(guān)于多糖含量測(cè)定，業(yè)內(nèi)有兩種評(píng)價(jià)方法。 一種是狹義上嚴(yán)格的多糖測(cè)定， 即水提取多糖后， 以凝膠色譜柱分離、 洗脫提純粗多糖 得到較單一分子量的多糖，再水解成各種單糖，以HPLC法分離測(cè)定各單糖，即可得到比較嚴(yán)格意義上的多糖含量及其組成。這種方法是科研級(jí)的多糖測(cè)定。另一種評(píng)價(jià)方法一般是生產(chǎn)企業(yè)用于質(zhì)控的多糖測(cè)定：一般過(guò)程是水提醇沉粗多糖后， 以葡萄糖作為相比較的物質(zhì)， 加入特定顯色劑后比色測(cè)定粗多糖的含量。 注意， 這種方法測(cè) 得的是以葡萄糖作為折算的多糖含量。但這種評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單實(shí)用，能反映一定的質(zhì)量指標(biāo)， 作為質(zhì)控之用可以的了。 包括中國(guó)藥典和一些國(guó)標(biāo)、 行標(biāo)都采用此方法評(píng)價(jià)多糖

2、含量， 方法 大同小異，如硫酸 -苯酚法，硫酸 -蒽酮法。但根據(jù)不少實(shí)際檢驗(yàn)人的反映，要想檢測(cè)結(jié)果有 很好的重現(xiàn)性，還是有很多細(xì)節(jié)問(wèn)題要注意的。粗多糖測(cè)定多糖的測(cè)定方法，目前有堿性酒石酸銅滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般說(shuō)來(lái)， 比色法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高， 樣品用量少； 但缺點(diǎn)是一般做常規(guī)檢測(cè)時(shí)使用葡萄糖 作標(biāo)準(zhǔn)品， 誤差較大，應(yīng)以被測(cè)物的純品作對(duì)照品，以求出換算因子，但要制備被測(cè)物的純品并非每個(gè)實(shí)驗(yàn)室所能做到的， 而且保健食品中往往是多種中草藥的提取物作為原料而制成， 所含多糖是不同相對(duì)分子量多糖的混合體， 這就給提取純品增加了難度。 所以當(dāng)成品中多糖 含量大于 1%（質(zhì)量濃度）

3、時(shí)，最好選用堿性酒石酸銅滴定。滴定法1. 樣品預(yù)處理取本品適量，精密稱定，置于 250ml 磨口燒瓶中，精密加水 50ml ，稱定重量，置沸水 浴回流 2 小時(shí)，放置至室溫， 用水補(bǔ)足減失重量， 混勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液 15ml 于 100ml 離心管中， 加無(wú)水乙醇 75ml ，混勻，以 4000r/min 離心 10min ，并小心棄去上清液 ,再加 15ml 熱水（溫度90 °C ）沖洗離心管中沉淀物,重復(fù)一次后再以 4000r/min離心30min，棄去上清液， 沉淀用乙醇液（水：乙醇 =15： 75）洗滌兩次，離心，棄去洗滌液。2. 樣品水解將離心管中醇析物用 50ml

4、熱水（溫度90C）少量多次轉(zhuǎn)移至250ml磨口三角瓶中，加 入15ml濃鹽酸，開(kāi)啟冷凝管，在沸水浴中回流2h,冷卻，先用40%的氫氧化鈉（約15ml） 粗調(diào)Ph值，后用稀的氫氧化鈉溶液細(xì)調(diào)，再置于PH計(jì)上調(diào)整pH在6.87.2之間。將中和的酸解液移置至 100ml 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻 ,過(guò)濾，濾液供滴定用。3. 堿性酒石酸鉀鈉銅溶液標(biāo)定3.1 精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各 5ml 于 150ml 的錐形瓶中，加 10ml 蒸餾水及 2 粒玻璃珠，用滴定管加入 9.0ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于錐形瓶中。3.2將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務(wù)必在 2分鐘內(nèi)至沸，并保持溶液在微沸狀態(tài)下再用 標(biāo)

5、準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定， 以每 2 秒 1 滴的速度滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)， 記錄消耗葡萄糖標(biāo) 準(zhǔn)溶液的總體積。同法平行操作三份，取其平均值（ V1）。3.3樣品溶液預(yù)測(cè)和測(cè)定。3.3.1 樣品溶液的預(yù)測(cè)精密吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各 5ml 于 150ml 的錐形瓶中，精密加入 10ml 蒸餾水及2 粒玻璃珠，控制在 2 分鐘內(nèi)加熱至沸，保持溶液在微沸狀態(tài)下以先快后慢的速度，從滴定 管中滴加樣品水解液液進(jìn)行滴定， 直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)， 記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗 體積。3.3.2 樣品溶液的測(cè)定精密吸取堿性酒石酸銅甲液與乙液各5.0ml，置于150ml錐形瓶中，精密加入蒸餾水10ml及玻璃珠

6、2粒,從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1ml的樣品水解液，將錐形瓶置電爐上迅速加熱，務(wù)必在 2 分鐘內(nèi)至沸， 并保持溶液在微沸狀態(tài)下再用樣品水解液滴定， 以每 2 秒 1 滴的速度 滴定至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)， 記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。 同法平行操作三份， 得出 平均消耗體積（ V2）。最后計(jì)算結(jié)果乘以 0.9，此為葡萄糖換算成粗多糖的細(xì)數(shù)。硫酸 -苯酚比色法1、方法提要食品中相對(duì)分子質(zhì)量>1X 104的高分子物質(zhì)在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和 低聚糖分離，用堿性二價(jià)銅試劑選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖， 用苯酚 -硫酸反應(yīng)以碳水化合物形式比色測(cè)定其含量，其顯

7、色強(qiáng)度與粗多糖中葡聚糖的含量 成正比，以此計(jì)算食品中粗多糖含量。方法原理：粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并 迅速脫水生成糖醛衍生物， 與苯酚縮合成有色化合物， 用分光光度法測(cè)定樣品在粗多糖含量。2、主要儀器（1）分光光度計(jì)；（ 2）離心機(jī)（ 3000r/min ）；（3）旋轉(zhuǎn)混勻器。3、試劑 本方法所用試劑除特殊注明外，均為分析純；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。（1）乙醇溶液（80%）： 20mL水中加入無(wú)水乙醇 80mL，混勻。（2） 氫氧化鈉溶液（100g/L）：稱取100g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L,加入固體 無(wú)水硫酸鈉至飽和，備用。（ 3）銅試劑儲(chǔ)備液：稱取 3.0gCuS

8、O4?5H2O， 30.0g 檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至 1L， 混勻，備用。（4） 銅試劑溶液：取銅試劑儲(chǔ)備液50mL,加水50mL,混勻后加入固體無(wú)水硫酸鈉12.5g 并使其溶解。臨用新配。（5）洗滌劑：取水 50mL，加入10mL銅試劑溶液、10mL氫氧化鈉溶液，混勻。（6） 硫酸溶液（10%）：取100mL濃硫酸加入到800mL左右水中，混勻，冷卻后稀釋至 1L。（7） 苯酚溶液（50g/L）：稱取精制苯酚 5.0g，加水溶解并稀釋至 100mL，混勻。溶液 置冰箱中可保存 1 個(gè)月。（8） 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取相對(duì)分子質(zhì)量5X 105已干燥至恒重的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 0.5000g,

9、加水溶解，并定容至50mL,混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.0mg葡聚糖。（9） 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL,置于100mL容量瓶中，加水 至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液 1mL 含葡聚糖 0.10mg。4、測(cè)定步驟（ 1 ）樣品處理：a、 沉淀粗多糖：準(zhǔn)確吸取液體樣品 5.0mL,置于50mL離心管中，加入無(wú)水乙醇20mL, 混勻 5min 后，以 3000r/min 離心 5min ，棄去上清液，反復(fù)操作 34 次。殘?jiān)盟芙獠⒍?容至5.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。b、 沉淀葡聚糖：準(zhǔn)確吸取 b項(xiàng)終溶液2mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫

10、氧化鈉 溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL,沸水浴中煮沸 2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去 上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?10%（體積 分?jǐn)?shù)）硫酸溶液 2.0mL 溶液并轉(zhuǎn)移至 50mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣 品測(cè)定液。（2） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、 0.10、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、1.00mL （相當(dāng)于葡聚糖 0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08> 0.10mg ）分別置于 25mL 比色管 中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至 2.0mL，加入50g/L苯

11、酚溶液1.0mL,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃 硫酸10.0mL，于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3） 樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品測(cè)定液 2.0mL置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液 1.0mL,在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻， 小心加入濃硫酸10.0mL于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻， 置沸水浴 中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在 485nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比， 1cm比色 皿測(cè)定吸光度值。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡聚糖含量， 計(jì)算樣品中粗多

12、糖含量。 同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)。5、結(jié)果計(jì)算X= （m1-m2） X V1X V3X V5/m3 X V2X V4X V6 式中X樣品中粗多糖含量（以葡聚糖計(jì)）（mg/g ）; ml 樣品測(cè)定液中葡聚糖的質(zhì)量 （mg）; m2 樣品空白液中葡聚糖質(zhì)量（ mg）; m3樣品質(zhì)量（g）；V1 樣品提取液總體積（mL） ； V2沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（ mL）；V3 粗多糖溶液體積（mL）; V4沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積（ mL）;V5樣品測(cè)定液總體積（mL）; V6測(cè)定用樣品測(cè)定溶液體積（mL）。6、準(zhǔn)確度與精密度在不同食品中進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為 87.8%110.87%，

13、不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣品進(jìn)行10 次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 5.8%。中藥總多糖含量測(cè)定（苯酚 -硫酸比色法）供試品溶液的制備：提取上清液：精密稱取樣品細(xì)粉2.2g （約相當(dāng)于多糖0.22g）,置燒瓶中，加水100ml置電爐上加熱回流提取 1.5h，放冷至室溫，30004000rpm離心10min , 收集上清液，用少量水分次洗滌燒瓶及離心管，同樣離心收集上清液。提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸發(fā)皿中，置電爐上小心加熱（避免焦化）濃縮到約15ml，放冷至室溫，加乙醇 100ml，攪勻，放置使其沉淀 15分鐘。轉(zhuǎn)移此溶液連同沉淀 于離心管中， 繼續(xù)用少量 80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸發(fā)皿，洗液和沉淀

14、同樣轉(zhuǎn)移至離心管中，以 30004000rpm 速度離心 15min ，棄去上清液， 在離心管中加入少量 80%乙醇，輕輕洗滌， 同樣離心棄去上清液（保留沉淀物） 。然后將離心管（連同沉淀物）于50 C烘箱揮干乙醇（不能見(jiàn)到任何液體），然后加熱水溶解沉淀， 轉(zhuǎn)移至 250ml 量瓶中，繼續(xù)用熱水以玻棒充分刮洗離心管， 洗液同樣轉(zhuǎn)移至 250ml 量瓶中，放冷至室溫，用水定容至刻度，搖勻，精密量取5ml 置 100ml 量瓶中，用水定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱取105 C干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖適量，加水配制成0.85mg/ml的貯備液。精密吸取 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0 ml 分別置于 50ml 量瓶中加水定容至刻度，搖 勻得葡萄糖稀釋液。 再分別精密量取上述各稀釋液 2 ml 置具塞試管中， 同時(shí)精密量取水 2.0 ml置另一具塞試管中，各管分別加5%苯酚溶液（新制）1 ml，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0ml，立即搖勻，于 40C水浴中保溫30min，取出，置冰水浴中 5 min。以上述2.0ml水所 制得的空白溶液做參比，于489nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液吸收度，以葡萄糖稀釋液的濃度 （卩g/ml）為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。備注：在