發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種

1、1會(huì)計(jì)學(xué)發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種四、發(fā)酵工業(yè)菌種保藏四、發(fā)酵工業(yè)菌種保藏第1頁(yè)/共130頁(yè)第一節(jié)第一節(jié) 常用發(fā)酵工業(yè)菌種常用發(fā)酵工業(yè)菌種第2頁(yè)/共130頁(yè)菌種選育有何意菌種選育有何意義？義？第3頁(yè)/共130頁(yè)n菌種選育方法主要包括自然選育、誘變育種、雜交育種和基因工程育種。第4頁(yè)/共130頁(yè)第5頁(yè)/共130頁(yè)第6頁(yè)/共130頁(yè)第7頁(yè)/共130頁(yè)工業(yè)發(fā)酵微生物可培養(yǎng)微生物未培養(yǎng)微生物少數(shù)少數(shù)大多數(shù)大多數(shù)缺乏敏感檢測(cè)技術(shù)缺乏敏感檢測(cè)技術(shù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩微生物間相互作用微生物間相互作用認(rèn)識(shí)不足無(wú)法原位培養(yǎng)認(rèn)識(shí)不足無(wú)法原位培養(yǎng)細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌第8頁(yè)/共130頁(yè)主要用

2、于生產(chǎn)酶制劑、有機(jī)酸、氨基酸、肌苷酸等。第9頁(yè)/共130頁(yè)nn大腸桿菌大腸桿菌可生產(chǎn)天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸以及谷氨酸脫羧酶、天冬酰酶等。第10頁(yè)/共130頁(yè)第11頁(yè)/共130頁(yè)主要用于生產(chǎn)多種抗生素多種抗生素，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。第12頁(yè)/共130頁(yè)主要用于生產(chǎn)食用、藥用和飼料用蛋白等。第13頁(yè)/共130頁(yè)的代謝進(jìn)行啤酒、白酒、黃酒和果酒等各種飲料酒的釀造，以及生產(chǎn)乙醇、甘油、有機(jī)酸及麥角固醇等多種產(chǎn)品。第14頁(yè)/共130頁(yè)主要用于生產(chǎn)酶制劑、有機(jī)酸、抗生素及甾體激素等。第15頁(yè)/共130頁(yè)第16頁(yè)/共130頁(yè)第17頁(yè)/共130頁(yè)研研究方法究方法1、模擬自然培養(yǎng)法、

3、模擬自然培養(yǎng)法：原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作。件優(yōu)化、單細(xì)胞操作。2、宏基因組分析法：測(cè)序分析未培養(yǎng)微、宏基因組分析法：測(cè)序分析未培養(yǎng)微生物的基因組，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，了解其生物的基因組，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，了解其代謝途徑、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等。代謝途徑、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等。第18頁(yè)/共130頁(yè)第二節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選第19頁(yè)/共130頁(yè)第20頁(yè)/共130頁(yè)第21頁(yè)/共130頁(yè)第22頁(yè)/共130頁(yè)從自然界篩選菌種從自然界篩選菌種第23頁(yè)/共130頁(yè)新種分離與篩選的步驟新種分離與篩選的步驟第24頁(yè)/共130頁(yè)第25頁(yè)/共130頁(yè)細(xì)菌、放線菌（有機(jī)質(zhì)豐富、陰暗潮濕）霉菌、酵母菌

4、微生物少第26頁(yè)/共130頁(yè)第27頁(yè)/共130頁(yè)第28頁(yè)/共130頁(yè)第29頁(yè)/共130頁(yè)第30頁(yè)/共130頁(yè)第31頁(yè)/共130頁(yè)第32頁(yè)/共130頁(yè)第33頁(yè)/共130頁(yè)第34頁(yè)/共130頁(yè) 劃線分離法劃線分離法平板劃線平板劃線法法第35頁(yè)/共130頁(yè)稀釋分稀釋分離法離法 稀釋倒稀釋倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平板。板。第36頁(yè)/共130頁(yè)樣品充分混勻；樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒每支移液管及涂布棒只能接觸一個(gè)稀釋度只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液；的菌液；同一稀釋度三個(gè)以上同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)重復(fù),取平均值；取平均值；

5、每個(gè)平板上的菌落數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；數(shù)；第37頁(yè)/共130頁(yè)第38頁(yè)/共130頁(yè)變色圈法 ; 透明圈法 ; 生長(zhǎng)圈法 ; 抑菌圈法 .第39頁(yè)/共130頁(yè)菌時(shí)，若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍就變成黃色，可從黃色圈中挑取菌落。第40頁(yè)/共130頁(yè)取所需菌落。第41頁(yè)/共130頁(yè)板培養(yǎng)基上涂布含菌樣品并恒溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。第42頁(yè)/共130頁(yè)第43頁(yè)/共130頁(yè)液進(jìn)行目的產(chǎn)物檢測(cè)或進(jìn)行菌種活性測(cè)定，通過(guò)比較可以初步篩選出少量生產(chǎn)能力較高的菌株。第44頁(yè)/共130頁(yè)現(xiàn)抑菌圈的菌落就是青霉素?；府a(chǎn)生菌。第45頁(yè)/共130頁(yè)第46頁(yè)/共

6、130頁(yè)條件進(jìn)行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，以便初步掌握野生型菌株適合的培養(yǎng)條件，為育種提供依據(jù)。第47頁(yè)/共130頁(yè)第48頁(yè)/共130頁(yè)第49頁(yè)/共130頁(yè)篩選模型：形態(tài)篩選模型：形態(tài)依據(jù)依據(jù)第50頁(yè)/共130頁(yè)測(cè)定測(cè)定第51頁(yè)/共130頁(yè)第三節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種的鑒定第52頁(yè)/共130頁(yè)第53頁(yè)/共130頁(yè)經(jīng)典的鑒定指標(biāo)經(jīng)典的鑒定指標(biāo)第54頁(yè)/共130頁(yè)第四節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種的改良第55頁(yè)/共130頁(yè)高產(chǎn)的新產(chǎn)品高產(chǎn)的新產(chǎn)品第56頁(yè)/共130頁(yè)第57頁(yè)/共130頁(yè)第58頁(yè)/共130頁(yè)第59頁(yè)/共130頁(yè)第60頁(yè)/共130頁(yè)僅影響一對(duì)堿基影響一段染色體第61頁(yè)/共130頁(yè)1. 出發(fā)菌株的選擇出

7、發(fā)菌株的選擇2. 菌懸液的制備菌懸液的制備3. 前培養(yǎng)前培養(yǎng)4. 誘變誘變5. 變異菌株的分離和篩選變異菌株的分離和篩選第62頁(yè)/共130頁(yè)2021-12-464第63頁(yè)/共130頁(yè)第64頁(yè)/共130頁(yè) 常用誘變劑及其類常用誘變劑及其類別別物理誘變劑化學(xué)誘變劑生物誘變劑堿基類似物 與堿基反應(yīng)的物質(zhì)在DNA分子中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基物質(zhì)紫外線快中子X(jué)射線射線激光2-氨基嘌呤5-溴尿嘧啶8-氮鳥(niǎo)嘌呤8-AG硫酸二乙酯（DES）甲基磺酸乙酯（EMS）亞硝基胍（NTG）亞硝基甲基脲（NMU）亞硝基乙基脲（NEU）亞硝酸（NA）氮芥（NM）4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）乙烯亞胺（EI）羥胺吖啶類

8、物質(zhì)ICR類物質(zhì)噬菌體ICR是美國(guó)腫瘤研究所（The Institute for Cancer Research）的縮寫，ICR化合物是該研究所合成的吖啶類的氮芥衍生物。第65頁(yè)/共130頁(yè)合適劑量：能擴(kuò)大變異幅度又能促使 變異移向正變范圍的劑量通常采用低劑量、長(zhǎng)時(shí)間處理。第66頁(yè)/共130頁(yè) 凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。第67頁(yè)/共130頁(yè)兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線線橫坐橫坐標(biāo)標(biāo)縱坐標(biāo)縱坐標(biāo) 劑量存活率劑量存活率曲線曲線誘變劑誘變劑的劑量的劑量細(xì)胞存活數(shù)細(xì)胞存活數(shù)的的對(duì)數(shù)值對(duì)數(shù)值 劑量誘變劑量誘變率曲線率曲線誘變劑誘變劑的

9、劑量的劑量誘變后獲得誘變后獲得的的突變細(xì)胞數(shù)突變細(xì)胞數(shù)第68頁(yè)/共130頁(yè)如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，曾發(fā)現(xiàn)如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，曾發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅色變深者往往產(chǎn)量有所提高。菌落的棕紅色變深者往往產(chǎn)量有所提高。第69頁(yè)/共130頁(yè)第70頁(yè)/共130頁(yè)類型類型示例示例活性離子N+、C+、O+、H+、P+惰性離子Ar+、Ne+金屬離子Fe+、Zn2+第71頁(yè)/共130頁(yè)和提高工業(yè)產(chǎn)量。和提高工業(yè)產(chǎn)量。第72頁(yè)/共130頁(yè)第73頁(yè)/共130頁(yè)第74頁(yè)/共130頁(yè)第75頁(yè)/共130頁(yè)第76頁(yè)/共130頁(yè)在瓊脂平板上，通過(guò)觀察測(cè)定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液

10、使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機(jī)取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長(zhǎng)圈的大?。y(cè)定生長(zhǎng)因子產(chǎn)生），纖維素酶對(duì)纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計(jì)某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標(biāo)。第77頁(yè)/共130頁(yè)第78頁(yè)/共130頁(yè)第79頁(yè)/共130頁(yè)第80頁(yè)/共130頁(yè)第81頁(yè)/共130頁(yè)第82頁(yè)/共130頁(yè)第83頁(yè)/共130頁(yè)第84頁(yè)/共130頁(yè)選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的

11、細(xì)胞作為親本脫壁酶脫壁酶細(xì)菌或放線菌可用細(xì)菌或放線菌可用溶菌酶溶菌酶或或青青霉素霉素處理，處理，真菌可用真菌可用蝸牛酶蝸牛酶或其他相應(yīng)的或其他相應(yīng)的脫壁酶脫壁酶等等離心聚集離心聚集在高滲溶液中稀釋在高滲溶液中稀釋加入促融合劑或電脈沖加入促融合劑或電脈沖各種選擇性培養(yǎng)基各種選擇性培養(yǎng)基原生質(zhì)體融合的主要步驟原生質(zhì)體融合的主要步驟是：是：第85頁(yè)/共130頁(yè)第86頁(yè)/共130頁(yè)化器中連續(xù)培養(yǎng)。n循環(huán)培養(yǎng)：在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。第87頁(yè)/共130頁(yè)中間代謝產(chǎn)物積累。4、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育：解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，終產(chǎn)物不斷積累?？狗答佂蛔冃秃涂棺瓒敉蛔冃?。第88頁(yè)/共130

12、頁(yè)應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株解除正常的反饋調(diào)節(jié)應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株解除正常的反饋調(diào)節(jié) 天冬氨酸天冬氨酸 磷酸天冬氨酸 半醛高絲氨酸 蘇氨 酸 甲硫 氨酸 C.glutamicum的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)賴氨酸為反饋抑制為阻遏AKHSDH第89頁(yè)/共130頁(yè)第90頁(yè)/共130頁(yè)大的創(chuàng)造具有工業(yè)應(yīng)用大的創(chuàng)造具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的生產(chǎn)菌株的潛力。價(jià)值的生產(chǎn)菌株的潛力。第91頁(yè)/共130頁(yè)和鑒定和鑒定外源基因的表外源基因的表達(dá)達(dá)第92頁(yè)/共130頁(yè)第93頁(yè)/共130頁(yè)第94頁(yè)/共130頁(yè)的體外定向進(jìn)化（隨機(jī)化突變、定向篩選）第95頁(yè)/共130頁(yè)n改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)n普遍用于菌種改良第96頁(yè)/共130頁(yè)第97頁(yè)/共1

13、30頁(yè)第98頁(yè)/共130頁(yè)代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。（3 3）構(gòu)建代謝旁路）構(gòu)建代謝旁路（4 4）改變能量代謝途徑）改變能量代謝途徑第99頁(yè)/共130頁(yè)第100頁(yè)/共130頁(yè)基因?qū)⒃瓉?lái)細(xì)胞中無(wú)關(guān)的兩基因?qū)⒃瓉?lái)細(xì)胞中無(wú)關(guān)的兩條代謝途徑橋連在一起，形條代謝途徑橋連在一起，形成新的代謝途徑。成新的代謝途徑。第101頁(yè)/共130頁(yè)第102頁(yè)/共130頁(yè)nn關(guān)鍵：確定希望表型的遺傳基礎(chǔ)。第103頁(yè)/共130頁(yè)第四節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏第104頁(yè)/共130頁(yè)工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因 菌種退化（degeneration）主要指生產(chǎn)菌種或選育過(guò)程中篩選出來(lái)的優(yōu)良菌株

14、，由于連續(xù)傳代或保藏之后，群體中某些生理和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失（包括菌株產(chǎn)孢子能力、發(fā)酵主產(chǎn)物產(chǎn)量下降）的現(xiàn)象。第105頁(yè)/共130頁(yè)1、退化的表現(xiàn)菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變：如蘇云金芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體變得小而少；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少：如細(xì)黃鏈霉菌的菌苔變薄、生長(zhǎng)緩慢，不再產(chǎn)生典型而豐富的橘紅色分生孢子層；第106頁(yè)/共130頁(yè)抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降：如藤倉(cāng)赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降；第107頁(yè)/共130頁(yè)2）連續(xù)傳代第108頁(yè)/共130頁(yè)1）從菌種選育方面考慮在育種過(guò)程中，應(yīng)盡可能使用孢子或單核菌株，避免對(duì)多核細(xì)胞進(jìn)行處理；在使單鏈突變的

15、同時(shí)，使另一條單鏈喪失模板作用，以減少出現(xiàn)分離回復(fù)現(xiàn)象；誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌株的“純度”。第109頁(yè)/共130頁(yè)2）控制傳代次數(shù) 如產(chǎn)腺苷的芽孢桿菌黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，回復(fù)子的比例隨傳代次數(shù)的增加而增加，腺苷產(chǎn)量也隨之下降。 3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件在進(jìn)行棲土曲霉培養(yǎng)時(shí)，溫度從28-30提高到33-34，可防止產(chǎn)孢子能力的衰退。第110頁(yè)/共130頁(yè)5）采用有效的菌種保藏方法 第111頁(yè)/共130頁(yè)1、純種分離法 在衰退菌種的細(xì)胞群中，一般還存在仍保持原有性狀的個(gè)體，設(shè)法對(duì)其進(jìn)行分離純化。2、淘汰已衰退的個(gè)體 采用高溫或低溫及其方法淘汰衰退的個(gè)體。 第112頁(yè)/共1

16、30頁(yè)3、選擇合適的培養(yǎng)條件 如平菇菌種在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代會(huì)導(dǎo)致菌種衰退，而在PDA綜合培養(yǎng)基（PDA中添加維生素和蛋白胨等）中培養(yǎng)則能使衰退的菌種復(fù)壯。第113頁(yè)/共130頁(yè)v菌種保藏的基本原理： 根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。一般可通過(guò)降低培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)成分、低溫、干燥和缺氧等方法，達(dá)到防止突變、保持純種的目的。第114頁(yè)/共130頁(yè)1斜面保藏法 這是一種最基本的方法，適用范圍廣，細(xì)菌、真菌和放線菌都可應(yīng)用。 3沙土管干燥保藏法： 這種方法適用于形成芽孢的細(xì)菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。其原理是將微生物吸附

17、在各種載體上，干燥后保藏。第115頁(yè)/共130頁(yè)第116頁(yè)/共130頁(yè)6低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在-20以下的低溫中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入12mL的菌液，直接放入低溫冰箱中保藏。 第117頁(yè)/共130頁(yè)第118頁(yè)/共130頁(yè)6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所第119頁(yè)/共130頁(yè)第120頁(yè)/共130頁(yè)5）日本東京科研化學(xué)有限公司KCC6）英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所NCTC7）美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所NIH8）美國(guó)農(nóng)業(yè)部北方開(kāi)發(fā)利用研究部NRRL 第121頁(yè)/共130頁(yè)第122頁(yè)/共130頁(yè)工業(yè)發(fā)酵微生物可培養(yǎng)微生物未培養(yǎng)微生物少數(shù)少數(shù)大多數(shù)大多數(shù)缺乏敏感檢測(cè)技術(shù)缺乏敏感

18、檢測(cè)技術(shù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩微生物間相互作用微生物間相互作用認(rèn)識(shí)不足無(wú)法原位培養(yǎng)認(rèn)識(shí)不足無(wú)法原位培養(yǎng)細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌第123頁(yè)/共130頁(yè)第124頁(yè)/共130頁(yè)第125頁(yè)/共130頁(yè)類型類型示例示例活性離子N+、C+、O+、H+、P+惰性離子Ar+、Ne+金屬離子Fe+、Zn2+第126頁(yè)/共130頁(yè)選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本脫壁酶脫壁酶細(xì)菌或放線菌可用細(xì)菌或放線菌可用溶菌酶溶菌酶或或青青霉素霉素處理，處理，真菌可用真菌可用蝸牛酶蝸牛酶或其他相應(yīng)的或其他相應(yīng)的脫壁酶脫壁酶等等離心聚集離心聚集在高滲溶液中稀釋在高滲溶液中稀釋加入促融合劑或電脈沖加入促融合劑或電脈沖各種選擇性培養(yǎng)基各種選擇性培養(yǎng)基原生質(zhì)體融合的主要步驟原生質(zhì)體融合的主要步驟是：是：第127頁(yè)/共130