魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定;開(kāi)放性化學(xué)實(shí)驗(yàn)探索

1、第 26 卷第 3 期搖 搖 大學(xué)化學(xué)Vol. 26 No. 3搖搖 2011 年 6 月UNIVERSITY CHEMISTRYJun. 2011魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定開(kāi)放性化學(xué)實(shí)驗(yàn)探索徐瑜搖 徐偉明搖 周晶(杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院浙江杭州搖 310036)搖 搖 摘要搖 以魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定為例,為學(xué)生開(kāi)設(shè)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn),使學(xué)生鞏固理論知識(shí),激發(fā)學(xué) 習(xí)興趣,提高實(shí)驗(yàn)操作技能,進(jìn)一步提高科研創(chuàng)新能力和綜合能力。搖 搖 關(guān)鍵詞搖 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)搖 魔芋搖 葡甘露聚糖搖 含量測(cè)定搖 搖 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)1鄄2 可以使實(shí)驗(yàn)室教學(xué)資源得到充分利用,學(xué)生可以運(yùn)用所學(xué)的化學(xué)知識(shí),結(jié)合實(shí)際,

2、自 己設(shè)計(jì)課題,采用合作學(xué)習(xí)的方式解決問(wèn)題。 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)?zāi)苁箤W(xué)生得到自主探索研究的機(jī)會(huì),對(duì)于提高 學(xué)生綜合素質(zhì)、培養(yǎng)創(chuàng)新意識(shí)和實(shí)踐能力很有意義。搖 搖 我們選擇了一個(gè)有教學(xué)意義、難度適宜的課題魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定,作為開(kāi)放性 化學(xué)實(shí)驗(yàn),對(duì)我?；瘜W(xué)類專業(yè)學(xué)生開(kāi)設(shè)。 該實(shí)驗(yàn)涉及有機(jī)化學(xué)、高分子化學(xué)、分析化學(xué)、儀器分析等課程 知識(shí)以及實(shí)驗(yàn)操作的綜合應(yīng)用。1搖 課題背景知識(shí)介紹搖 搖 魔芋是一種草本植物,是我國(guó)的特產(chǎn),廣泛分布于長(zhǎng)江流域。 魔芋球莖中含有葡甘露聚糖(KGM)、 淀粉、生物堿、纖維素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,其中 KGM 是一種優(yōu)良的低熱量、低脂肪、高纖維素的水溶 性膳食纖維。 許多

3、研究表明,KGM 具有降血糖、降血脂及逆轉(zhuǎn)脂肪肝、通便減肥、抗癌、增強(qiáng)免疫功能、 抗衰老等3 保健作用和醫(yī)療功效。 魔芋葡甘露聚糖有獨(dú)特的理化性質(zhì)和一些優(yōu)良的特性,如強(qiáng)吸水性、可食用性、流變性、增稠性、凝膠性和成膜性,在制藥工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的 應(yīng)用。搖 搖 魔芋葡甘露聚糖是已知植物膠中黏度最大的天然高分子多糖,其分子式為( C6 H10 O6 ) n 。 對(duì) KGM 化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的有關(guān)報(bào)道很多,但其確切結(jié)構(gòu)至今尚無(wú)定論,奧山典生等人推測(cè)它的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。圖 1搖 KGM 的推測(cè)結(jié)構(gòu)5鄄6搖 第 3 期徐瑜等:魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定開(kāi)放性化學(xué)實(shí)驗(yàn)探索592搖

4、 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)搖 搖 有多種用于評(píng)價(jià)魔芋精粉和相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的方法;KGM 含量是評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。 KGM 含量的測(cè) 定方法有很多種,有費(fèi)林滴定法、3,5鄄二硝基水楊酸法(DNS 法)、甘露糖膠重量法、苯酚比色法、旋轉(zhuǎn)黏 度法、薄層色譜法、氣相色譜法4 和高效液相色譜法,每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。 根據(jù)這一情況,可 讓學(xué)生查找相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)自己的知識(shí)水平和興趣,選擇一種或幾種測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 進(jìn)行分析和比較;然后采用小組討論的形式探討是否可行;再由教師把關(guān),逐一進(jìn)行評(píng)價(jià);最后制定出最 佳實(shí)驗(yàn)方案。 這一過(guò)程有助于開(kāi)闊學(xué)生的思維,培養(yǎng)學(xué)生比較辨別的能力。 高年級(jí)的學(xué)生還可對(duì)所用測(cè)定方

5、法中不同因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的作用和影響進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。2. 1搖 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作搖 搖 學(xué)生選擇某種測(cè)定方法后,根據(jù)文獻(xiàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用化學(xué)藥品、試劑和儀器,其中遇到如氣相色譜儀、液相色譜儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等大型儀器時(shí),還需進(jìn)一步學(xué)習(xí)和鞏固這些儀器的實(shí)驗(yàn)原理和操作方 法。2. 2搖 樣品的預(yù)處理?yè)u 搖 樣品的預(yù)處理即 KGM 的提取方法有好幾種:酸性冷溶法、酶解法、沸水溶解法、乙醇沉淀法、超聲 波提取法、甲酸鄄氫氧化鈉緩沖液溶脹法等。 每種提取方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn),學(xué)生可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條 件和實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇感興趣的方法。2. 3搖 實(shí)驗(yàn)操作搖 搖 選擇好樣品測(cè)定方法和預(yù)處理方式后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。2. 3.

6、 1搖 3,5鄄二硝基水楊酸法( DNS 法)搖 搖 選擇甲酸鄄氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取 KGM,制作標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液的曲線,確定最大吸收波長(zhǎng),制備 KGM 水解液,選擇一定的顯色時(shí)間、DNS 添加量、水解酸度和水解時(shí)間等因素進(jìn)行檢測(cè),按下式算 出 KGM 的含量:搖搖搖搖w(KGM)= 著 伊(5T樣 - T白)伊 50m搖 搖 式中 w(KGM)為 KGM 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)( 下同);著 為甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的殘基分子 量與葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量之比;T樣 為水解液的吸光度值;T白 為空白 樣的吸光度值;m 為魔芋粉樣品質(zhì)量。2. 3. 2搖 高效液相色譜

7、法7搖搖選擇超聲波提取法來(lái)提取 KGM,制作含葡萄糖、甘露糖均為 0. 1mmol / L 標(biāo)準(zhǔn)混合液的工作曲線,制備 KGM 水解液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行操作,衍生化后采用反相高效液相色譜法,分段梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為 250nm,按下式計(jì)算 KGM 含量:搖搖搖 搖 w(KGM) =(mM+ mG )伊 14. 59m搖搖式中 mM 為樣品中甘露糖質(zhì)量;mG 為樣品中葡萄糖質(zhì)量;m 為樣品魔芋精粉的質(zhì)量。2. 3. 3搖 甘露糖腙重量法8搖 搖 選擇酸性水解法提取 KGM,冷卻后過(guò)濾,收集濾液,調(diào)節(jié) pH 至 3. 0,加苯肼混合,室溫條件下靜置18 20h,用已干燥至恒重( m1 ) 的定量濾

8、紙過(guò)濾, 洗滌沉淀及濾紙, 將帶有沉淀的濾紙烘干至恒重(m2 ),按下式計(jì)算 KGM 含量:60大學(xué)化學(xué)第 26 卷?yè)u搖搖搖 搖 w(KGM) =m2- m1伊 1. 0351m搖搖式中 m 為樣品質(zhì)量;m1 為干燥濾紙質(zhì)量;m2 為干燥沉淀和濾紙的總質(zhì)量;1. 0351 為由甘露糖到葡甘聚糖的換算系數(shù)。2. 3. 4搖 苯酚比色法9搖搖選擇乙醇沉淀法提取 KGM,繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液的曲線,配制 KGM 樣品液,加入 6. 0% 苯酚試劑,于冰水浴中加適量濃硫酸,冷卻后于 490. 0nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,按下式計(jì)算 KGM 含量:搖搖搖 搖 w(KGM) =著 伊 籽1籽2搖搖式中著 為多

9、糖的校正系數(shù);籽1 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品質(zhì)量濃度;籽2 為加入樣品的質(zhì)量濃度。2. 4搖結(jié)果分析搖 搖 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)操作,學(xué)生可以感受到整個(gè)科學(xué)研究的過(guò)程,對(duì)不同的測(cè)定方法得到的結(jié)果進(jìn)行分析 和比較,總結(jié)出最佳的實(shí)驗(yàn)條件;還可進(jìn)一步進(jìn)行放大試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等,分 析誤差產(chǎn)生的原因和操作的關(guān)鍵,總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。2. 4. 1搖 DNS 比色法搖 搖 DNS 比色法的測(cè)定原理是:魔芋葡甘露聚糖水解后生成甘露糖和葡萄糖兩種還原糖,3,5鄄二硝基水 楊酸與還原糖共熱后生成棕色的氨基化合物,在一定范圍內(nèi),還原糖的量同反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān) 系,利用比色法可測(cè)定魔芋中葡甘露聚糖的含量

10、。搖 搖 在 KGM 的提取方法上要說(shuō)明以下幾點(diǎn):1) 常規(guī)水提法的不足之處是魔芋粉水溶脹后,溶液較渾 濁,顆粒多且破碎不完全,導(dǎo)致 KGM 不能完全溶出,KGM 含量測(cè)定值偏低,提取時(shí)間長(zhǎng);2) 超聲波提取 法利用超聲波具有的機(jī)械振動(dòng)能、熱學(xué)性能和強(qiáng)大的空化效應(yīng),用超聲波清洗器在除去魔芋精粉中的游 離還原糖后,超聲提取魔芋精粉中的 KGM 并進(jìn)行檢測(cè),與常規(guī)水提法相比,該方法提取時(shí)間縮短,提取 效率提高;3) 甲酸鄄氫氧化鈉緩沖液溶脹法提取效率高,簡(jiǎn)單快速,結(jié)果可靠,省去了常規(guī)法、超聲水提 法中用 85% 乙醇除去游離還原糖的操作,通過(guò)試樣空白對(duì)照扣除,以獨(dú)特的定容方法避免了轉(zhuǎn)移過(guò)程 中容器

11、壁上附著 KMG,從而使結(jié)果更加準(zhǔn)確,實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性高。搖 搖 DNS 比色法不需昂貴的大型分析儀器,操作簡(jiǎn)便,容易上手,但此法中氨基化合物的吸光度隨時(shí)間 的變化而變化,必須使葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色反應(yīng)后存放時(shí)間與樣品溶液的顯色反應(yīng)后存放時(shí)間一致, 以減少因顯色反應(yīng)后存放時(shí)間不同而造成的分析誤差;另外此法不能得出 KGM 分子中甘露糖和葡萄 糖的物質(zhì)的量比。2. 4. 2搖 高效液相色譜法搖 搖 高效液相色譜法首先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)混合液中甘露糖和葡萄糖這兩種單糖間的校正因子,把樣品中甘露 糖和葡萄糖的峰面積與內(nèi)標(biāo)物鼠李糖峰面積的比值分別代入各自的線性回歸方程,求得各自的量,再經(jīng) 計(jì)算得樣品的 KGM 含量與

12、兩種單糖的比例。搖 搖 該方法分離效率高,分析快速,定量準(zhǔn)確,檢測(cè)時(shí)間較短,準(zhǔn)確度較高,能同時(shí)測(cè)定 KGM 含量及其 單糖組成。 但儀器昂貴,所需試劑比其他方法偏貴,實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。2. 4. 3搖 甘露糖腙重量法搖 搖 甘露糖腙重量法的原理是甘露糖與苯肼反應(yīng),生成甘露糖腙,而葡萄糖對(duì)甘露糖與苯肼反應(yīng)沒(méi)有影 響,甘露糖在葡甘露聚糖中以一定比例存在,只要葡甘露聚糖徹底水解,就可以準(zhǔn)確測(cè)出甘露糖的含量, 通過(guò)換算能夠得到 KGM 的含量。搖 第 3 期徐瑜等:魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的測(cè)定開(kāi)放性化學(xué)實(shí)驗(yàn)探索61搖 搖 此法不受淀粉、纖維素及其他可溶性糖的影響,沒(méi)有溶脹及分離雜質(zhì)的麻煩,但分析過(guò)程中

13、被分析 組分易損失,誤差大。2. 4. 4搖 苯酚比色法搖 搖 苯酚比色法的測(cè)定原理是:先用 50% 乙醇浸泡,離心,除去單糖、雙糖、低聚糖、苷類、生物堿等干擾 成分,然后用水提取其中所含的可溶性多糖,多糖類成分在濃硫酸作用下,水解生成單糖,再與苯酚縮合 生成黃色化合物,顏色深淺與糖的濃度成正比,從而可求得 KGM 含量。 此法與 DNS 比色法類似。搖 搖 該方法測(cè)定 KGM 含量簡(jiǎn)單快速,穩(wěn)定性好,易操作,原料簡(jiǎn)單價(jià)廉,但操作要仔細(xì),否則令結(jié)果偏 低,標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液的濃度需合理配制,吸光度需控制在一定范圍內(nèi)。2. 4. 5搖 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐與分析搖 搖 我們發(fā)現(xiàn)最初學(xué)生得到這個(gè)課題后根本

14、不知道該從哪里下手,只是像平時(shí)一樣,期待教師把具體的 實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)步驟明明白白地寫(xiě)下來(lái)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 經(jīng)過(guò)指導(dǎo)教師講解如何進(jìn)行文獻(xiàn)檢索及如何確定 實(shí)驗(yàn)方案的演示,學(xué)生能逐漸進(jìn)入到研究狀態(tài),自己尋找感興趣的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在此過(guò)程中發(fā) 現(xiàn)不理解的和有疑問(wèn)的地方能主動(dòng)探討,學(xué)生的積極性和熱情較高。搖 搖 在這個(gè)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)學(xué)生最容易掌握甘露糖腙重量法,但初期實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大; 對(duì)于 DNS 比色法和苯酚比色法,學(xué)生掌握的難易情況次之,主要是對(duì)試劑的預(yù)處理不夠好,數(shù)據(jù)處理和 計(jì)算公式的推導(dǎo)不熟練;較難掌握的一種方法是高效液相色譜法,由于涉及到大型儀器高效液相色譜 儀,對(duì)實(shí)驗(yàn)原理的理

15、解和實(shí)驗(yàn)操作都有一定的困難。 學(xué)生采用這些方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)是要先準(zhǔn)確掌 握各種實(shí)驗(yàn)方法的測(cè)定原理,這樣在后面的實(shí)驗(yàn)操作中才能做到胸有成竹。搖 搖 通過(guò)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn),學(xué)生不僅系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)的能力得到顯著提高,而且通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的多次重復(fù),從實(shí) 驗(yàn)原理分析誤差的來(lái)源,實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力也大有提高;另外,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)學(xué)習(xí)超聲波清洗器、紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)、高效液相色譜儀等大型儀器的使用,培養(yǎng)了學(xué)生綜合運(yùn)用多門化學(xué)課程的相關(guān)知識(shí)的 能力;最后,同學(xué)之間還可以通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和影響因素的分析、比較,在學(xué)會(huì)體會(huì)實(shí)驗(yàn)方法的多樣性帶 來(lái)樂(lè)趣的同時(shí),掌握科學(xué)研究的嚴(yán)謹(jǐn)性。3搖 結(jié)語(yǔ)搖 搖 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,可能會(huì)出現(xiàn)各種意

16、外情況,教師要及時(shí)作必要的指導(dǎo)和調(diào)整。 開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)突出了學(xué) 生的主體地位,這種模式對(duì)提高學(xué)生的創(chuàng)新能力和綜合能力是非常重要的。參搖 考搖 文搖 獻(xiàn)1 搖 李文杰. 重慶工學(xué)院學(xué)報(bào),2006,20(6):1572 搖 王潤(rùn)孝,李小聰. 中國(guó)高等教育,2005,9:373 搖 古元冬,史建勛,胡卓逸. 中草藥,1999,30(2):1274 搖 廖燕芝,楊代民,張繼紅,等. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,27(4):665 搖 張秋云. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2008,5:696 搖 喻玲玲,鄒坤. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(3):6807 搖 袁忠海,吳道澄,趙燕,等. 中國(guó)中藥雜志,2003,28(7):6218 搖 王中鳳,張盛林,劉佩瑛,等. 食品與發(fā)酵工業(yè),2001,27(10):539 搖 易春艷,李佳鳳,余愛(ài)農(nóng),等. 食品工業(yè)科技,2006,27(4):177書(shū)是我們時(shí)代的生命別林斯基書(shū)籍是巨大的力量