免疫組織化學(xué)技術(shù)-文檔資料

1、1 免疫組織免疫組織/細胞化學(xué)細胞化學(xué) IHC/ICC主要內(nèi)容免疫組織化學(xué)概況免疫組化實驗步驟和試劑常見問題及處理方法多色標(biāo)記3免疫組織/細胞學(xué)簡介免疫組織學(xué)免疫組織學(xué) 是一種把分子水平的物質(zhì)在組織原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)進行定性、定位測定，準(zhǔn)確具體表達出來的一種方法。這些分子水平的物質(zhì)可能與癌細胞、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等等有關(guān)技術(shù)平臺技術(shù)平臺組織切片或細胞爬片純化的一抗（單克隆或多克?。?biāo)記的二抗(酶、金顆?；蛘邿晒猓╋@色系統(tǒng)（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） 檢測系統(tǒng)（普通或熒光顯微鏡）免疫組織學(xué)方法分類免疫組織學(xué)方法分類酶免疫組織化

2、學(xué)染色（IHC） IHC-Fr：冰凍切片 IHC-P：石蠟切片熒光免疫組織染色（IF） 多用于冰凍組織切片或者細胞爬片膠體金免疫組織染色（GIHC）根據(jù)標(biāo)本類型分類石蠟切片：用酶免疫組織染色冰凍切片：多用熒光免疫染色細胞爬片：多用熒光免疫染色免疫組化相關(guān)名稱簡寫簡寫中文名稱中文名稱ICC 免疫細胞化學(xué)免疫細胞化學(xué)ICC/IF 免疫熒光（細胞標(biāo)本）免疫熒光（細胞標(biāo)本） IHC-P 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) (石蠟切片石蠟切片) IHC-Fr 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué) (冰凍切片冰凍切片) IF免疫熒光免疫熒光IHC 免疫組織化學(xué)IHC (Methanol fixed) 免疫組織化學(xué) (甲醇固定)

3、 IHC (PFA fixed) 免疫組織化學(xué) (PFA 固定標(biāo)本) IHC-FoFr 免疫組織化學(xué) (灌注固定冰凍切片) IHC-FrFl 免疫組織化學(xué) - Free Floating IHC-G 免疫組織化學(xué) (Glycolmethacrylate sections) IHC-Glut 免疫組織化學(xué) (PFA-glutharaldehyde fixed) IHC-M 免疫組織化學(xué) (Methylmethacrylate sections) 酶免疫組織化學(xué)（酶免疫組織化學(xué)（IHC）常用方法）常用方法v PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP；v LAB/LSAB：

4、二抗 生物素(Biotin) + HRP-親和素；v S-P/SAP： 二抗 生物素 + 鏈酶親和素-HRP/AP；v ABC/SABC：親和素/鏈酶親和素-生物素化HRP/AP復(fù)合物；v非Biotin/Avidin方法/Envision兩步法：二抗直接偶聯(lián)酶10S-P/LAB方法復(fù)合物:鏈酶親和素-HRP/AP11基本原理S-P/LAB方法:一個親和素和多個標(biāo)記酶（HRP）結(jié)合，多個生物素與抗體（一抗或二抗）結(jié)合，細胞的抗原（或一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，既而將酶標(biāo)記的親和素結(jié)合在生物素上，最后進行顯色反應(yīng)定位。12ABC方法ABC復(fù)合物:親和素-生物素化HRP/APA親和素，B生物素，C

5、復(fù)合物13基本原理ABC法：先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成ABC復(fù)合物，抗原先后與特異性一抗、生物素化二抗、ABC復(fù)合物結(jié)合，形成巨大復(fù)合物（網(wǎng)絡(luò)大量酶分子），最后顯色。14二抗直接偶聯(lián)酶的Polymer俗稱兩步法15基本原理Envision兩步法：抗原與抗體反應(yīng)結(jié)合后，第二抗體上標(biāo)記有多聚化合物酶復(fù)合物（EnVision復(fù)合物），與第一抗體結(jié)合，進而由酶作用底物進行顯色定位。16熒光免疫組織染色方法使用熒光標(biāo)記抗體，直接定位、定性檢測組織或細胞蛋白表達情況。較免疫組化具有靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點。缺點是染色組織片不能長期保存17IF常用熒光素FITC：綠色，激發(fā)波長488nm；發(fā)

6、射波長515nmRhodamine：橙色，激發(fā)波長570nm；發(fā)射波長570-590nmTexas Red：紅色，激發(fā)波長589nm；發(fā)射波長570-615nmCy3：橙色，激發(fā)波長512/550nm；發(fā)射波長570nmCy5：紅色，激發(fā)波長625/650nm；發(fā)射波長670nm18免疫組化實驗注意事項正確選配抗體 一抗必須是說明書上經(jīng)過驗證(tested application)可以用于IHC(IHC-P;IHC-Fr)檢測的 二抗必須是和一抗來源及亞型相配套的 正確設(shè)置合適的對照正確選配固定方法和修復(fù)方法正確選配顯色系統(tǒng)19免疫組化實驗對照設(shè)置陽性對照：判斷染色全過程和所有試劑的正確性：A

7、、內(nèi)部對照：對照組織本身明確存在的抗原（二抗系統(tǒng)的正確性）B、外部對照：明確表達待測抗原的組織或細胞（一抗的工作性）陰性對照：明確不表達待測抗原的組織或細胞二抗對照：不加一抗，余操作相同20免疫組化基本操作步驟及需要的試劑21免疫組化基本操作步驟22Envision二步法操作步驟1、組織切片60預(yù)熱2、常規(guī)脫蠟入水（二甲苯、各級酒精、水）3、抗原修復(fù)4、PBS/T洗3次，5min/次5、3%H2O2 RT 10min（封閉內(nèi)源HRP）6、PBS/T洗3次，5min/次7、10%正常山羊血清RT 30min（阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R）8、一抗4 孵育過夜9、PBS/T洗3次，5min/次10

8、、二抗RT 30min11、PBS/T洗3次，5min/次12、DAB顯色，顯微鏡下觀察，控制顯色程度13、充分水洗14、蘇木素復(fù)染核15、1%鹽酸酒精分化16、充分水洗返藍17、脫水、透明，中性樹膠封片231、載玻片處理重酪酸鉀濃硫酸浸泡24hddH2O漂洗95%乙醇浸泡12h防脫粘片劑處理： Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent可直接購買處理好的載玻片242、組織固定石蠟切片冰凍切片細胞涂片組織固定液10%中性福爾馬林4%多聚甲醛冷丙酮，4%多聚甲醛甲醇、乙醇特點需要修復(fù)不需修復(fù)，冷丙酮固定不需破膜不需修復(fù)如果待測蛋白位于細胞漿或者細胞核內(nèi)，同時還需要進

9、行破膜處理標(biāo)本類型及常用固定液標(biāo)本類型及常用固定液253、抗原修復(fù)加熱修復(fù)技術(shù)修復(fù)方法修復(fù)方法：微波加熱修復(fù)、高壓熱修復(fù)、煮沸熱修復(fù)：常用常用buffer：檸檬酸Buffer:0.01M, pH6.0 EDTA buffer: pH9.0非加熱修復(fù)技術(shù)胃蛋白酶(細胞內(nèi)抗原): 0.4%,37,30mins 胰酶(細胞間抗原): 0.05-0.25%,37,10-15mins Proteinase K : 20ug/ml26正常血清正常血清(5-10%)：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-RBSA (5%) ：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R特殊封閉試劑特殊封閉試劑：當(dāng)使用小鼠源性抗體檢測小鼠組織抗原時內(nèi)源

10、性生物素內(nèi)源性生物素/親和素親和素：有些組織如腎臟、肝臟、脾臟含有很高的內(nèi)源性生物素，如使用SP或者ABC試劑盒需要進行封閉封閉條件：室溫 30-120mins如是HRP系統(tǒng)，則同時需要使用3% H2O2室溫10-30mins淬滅內(nèi)源性HRP的活性4、封閉、封閉275、一抗孵育選擇驗證過待測種屬和實驗方法的一抗根據(jù)說明書上推薦的固定和修復(fù)方法處理標(biāo)本說明書推薦的稀釋比例僅作參考，需要根據(jù)標(biāo)本類型來摸索最佳稀釋比例一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中4過夜286、二抗及酶標(biāo)記物孵育根據(jù)一抗的來源和Ig亞型選擇合適的二抗根據(jù)說明書推薦的稀釋比例和標(biāo)本類型摸索最佳稀釋比

11、例一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中室溫(RT) 30-60mins也可以選擇商業(yè)化的試劑盒：SP,ABC或者兩步法297、顯色 HRP AP AEC（red) Fast Red(pink) DAB(brown/gray)BCIP/NBT(blue/violet) 根據(jù)所用酶類型選擇合適的顯色底物308、復(fù)染、復(fù)染蘇木素(染核,藍色)甲基綠(染核,綠色)核固紅(染核,紅色)DAPI(染核,蘭色)AEC,DAB,AP Red/Fast Red, 免疫金-銀染色DAB, BCIP/NBTBCIP/NBT熒光319、脫水/透明/封片AEC,AP Red/ Fast R

12、ed, 和其它有機染料DAB,New Fuchsin, Vega Red,BCIT/NBT和其它水溶性染料熒光染料不需脫水、透明脫水、透明脫水、透明水溶性封片劑如AEC封片劑 有機封片劑如中性樹膠水溶性封片劑，最好是含熒光抗淬滅成分的(PE不能用含甘油的封片劑)3210、結(jié)果觀察普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡33IHC/ICC常見問題分析34常見問題及處理方法常見問題及處理方法 組織脫片 非特異性背景染色 染色弱 無陽性染色35載玻片處理不充分組織固定、脫水、透明不充分組織切片太厚（5um)組織切片有折疊過度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）抗原修復(fù)液的pH值偏高操作過程中沖洗方法不正確組織脫片常見原

13、因組織脫片常見原因36封閉不充分封閉不充分：增加封閉試劑濃度、延長封閉時間沖洗不充分沖洗不充分：短時間多次數(shù)的洗滌更有效實驗過程中切片干燥實驗過程中切片干燥：試劑量充足，注意觀察，避免干片組織切片折疊組織切片折疊組織抗原彌散組織抗原彌散：組織標(biāo)本及時固定，選擇合適的固定液抗原修復(fù)不充分抗原修復(fù)不充分：更改修復(fù)方法，優(yōu)化時間內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素/親和素親和素：使用封閉試劑或者不用SP/ABC系統(tǒng)二抗原因二抗原因：選擇Fab段的抗體或者吸附過的抗體，設(shè)置二抗對照一抗原因一抗原因：抗體濃度過高：降低抗體濃度、建議4過夜選擇純化的抗體設(shè)置陽性對照試劑污染試劑污染：重新配置新的緩沖液和試劑非特異性背景染色非特異性背景染色37組織固定、包埋時抗原被破壞抗原位于細胞內(nèi)，未使用破膜劑(尤其是定位于細胞核)抗體濃度過低，孵育時間過短操作中滴加試劑時緩沖液未漓干，致使試劑稀釋室內(nèi)溫度15 過度封閉試劑超過有效期抗體保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低染色過程中未避光（熒光染色）染色弱常見原因染色弱常見原因38操作錯誤（漏加試劑）組織中無抗原固定、包埋、修復(fù)時抗原被破壞修復(fù)方法不當(dāng)一抗與二抗不匹配底物和酶不匹配封閉過度封片劑選擇不當(dāng)一種或多種試劑活性降低或失活抗原位于細胞內(nèi)，未使用破膜劑無陽性染色常見原因無陽性染色常見原因39多標(biāo)記檢測40多標(biāo)記染色法多標(biāo)記染色法適用于同一組織片23個不同抗原