溶菌酶及其應(yīng)用

1、Lysozyme Action Lysozyme Action And Application And Application 溶菌酶及其應(yīng)用溶菌酶及其應(yīng)用 05生物技術(shù)生物技術(shù) 江浩江浩 81050423 溶菌酶的誕生溶菌酶的誕生 溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)溶菌酶的分子結(jié)構(gòu) 溶菌酶的種類溶菌酶的種類 影響溶菌酶活性的因素影響溶菌酶活性的因素 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 溶菌酶的應(yīng)用溶菌酶的應(yīng)用 溶菌酶溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又稱細(xì)胞壁質(zhì)酶（Murami dase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-Acetyl muramide Glycanohydralase）。在人和動(dòng)物的多種組

2、織、分泌液及某些植物、微生物中均發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)不僅有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的溶菌酶，還有作用于真菌細(xì)胞壁的種類，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制也有了更進(jìn)一步的了解。近幾年，人們根據(jù)溶菌酶的溶菌特性，將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品防腐、畜牧及生物工程中，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。 亞歷山大弗萊明(Alexander Fleming)，1881年8月6日出生于蘇格蘭艾爾郡洛奇菲爾德。他是蘇格蘭農(nóng)民的后裔，家境貧寒。 因發(fā)現(xiàn)了青霉素以及它對(duì)多種傳染性疾病的治療作用，榮獲1945年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1922年的一天，正在感冒的英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)，把一些鼻粘液加入細(xì)菌的培養(yǎng)基

3、后會(huì)引起細(xì)胞的溶解。而這種存在于鼻粘液中的能殺死細(xì)菌的重要物質(zhì)被認(rèn)為是一種酶， Fleming命名其為溶菌酶（ Lysozyme ）。 溶菌酶相對(duì)分子質(zhì)量為14.6X103，由129個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，含有4對(duì)二硫鍵。 溶菌酶分子近橢圓形，大小為4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的構(gòu)象比較復(fù)雜，螺旋僅占25%，在分子的一些區(qū)域有伸展著的片層構(gòu)象。 在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射線晶體（X-ray crystallography）結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)(tertiary structure)。 其三維立體結(jié)構(gòu)主要是由多肽鏈

4、借助于各種次級(jí)鍵盤繞成具有特定走向的緊密球狀結(jié)構(gòu)，維持這種結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵力、范德華力、疏水作用力和鹽鍵力。 溶菌酶的三溶菌酶的三維立體結(jié)構(gòu)維立體結(jié)構(gòu) 按其作用可分類按其作用可分類 按出處分類按出處分類 1.1.細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶 作用于-1，4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶解酶 另一種是作用于肽“尾”和酰胺部分的細(xì)胞 壁溶解酶 2.2.真菌細(xì)胞壁溶菌酶真菌細(xì)胞壁溶菌酶 酵母菌細(xì)胞壁溶解酶 霉菌細(xì)胞壁溶解酶。 按出處分類按出處分類 1. 1. 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%3.5%，作為溶菌酶類的典型代表，是目前重點(diǎn)研究的對(duì)象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它

5、由18種129個(gè)氨基酸殘基組成，具有4個(gè)S-S鍵，分子量為14 000，等電點(diǎn)為11.1，最適溫度為50，最適pH值為67，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在pH1.211.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變。遇熱也很穩(wěn)定，在pH47、100處理1min不失活，是一種穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)，但在堿性條件下對(duì)熱穩(wěn)定性較差。 其它鳥類如鵪鶉、珍珠雞、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶，與雞蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129個(gè)氨基酸組成，雖排列順序有所不同，但活性部位的氨基酸排列則大體相同。 2. 2. 人及哺乳動(dòng)物溶菌酶人及哺乳動(dòng)物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴

6、組織中，1ml眼淚中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.10.5mg。人溶菌酶由130個(gè)氨基酸殘基組成，有4個(gè)S-S鍵，分子量為14 600，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。 對(duì)于哺乳動(dòng)物溶菌酶，目前已從牛、豬、貓、兔、猴、馬、羊等動(dòng)物的乳汁中分離出溶菌酶，其化學(xué)性質(zhì)與人溶菌酶相似，但結(jié)構(gòu)尚不清楚，其溶菌活性也遠(yuǎn)低于人溶菌酶約3 000倍。曾林（1999）采用瓊脂平板法測(cè)定家兔初乳溶菌酶含量。結(jié)果表明：初乳溶菌酶含量為（7.962.01）g/ml，常乳溶菌酶含量(5.011.32)g/ml。人及哺乳動(dòng)物溶菌酶的作用機(jī)制與雞蛋清溶菌酶相同。 3. 3. 植物溶菌酶植物溶菌酶 目前已從木瓜、無(wú)花果、

7、蕪菁、大麥等植物中分離出溶菌酶，其分子量較大，約為24 00029 100。植物溶菌酶對(duì)溶壁小球菌的溶菌活性不超過(guò)雞蛋清溶菌酶的1/3，但對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。周澤文（1994）從菜心分離溶菌酶表明，酶比活力達(dá)3 414. 6U/mg，純化倍數(shù)為197.4。菜心溶菌酶在較寬的溫度和pH植范圍內(nèi)均有活性，最適溫度為60，最適pH值為5.8。高向陽(yáng)（1997）研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿3種革蘭氏陽(yáng)性菌和變形菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌、產(chǎn)氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母、總狀毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5種真

8、菌的抑菌效果。同時(shí)還研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、番茄青枯病菌、水稻細(xì)條病菌、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細(xì)菌的抑菌效果。試驗(yàn)證明：蘿卜溶菌酶對(duì)上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。 4. 4. 微生物產(chǎn)生的溶菌酶微生物產(chǎn)生的溶菌酶 目前微生物產(chǎn)生的溶菌酶分為7類：內(nèi)N-乙酰已糖胺酶，此酶同于雞蛋清溶菌酶，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的-1，4糖苷鍵；酰胺酶，切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中NAM與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵；內(nèi)肽酶，使肽“尾”及肽“橋”內(nèi)的肽鍵斷裂；-1，3、-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁；殼多糖酶，與葡聚糖酶共同作用，可分

9、解霉菌和酵母；磷酸甘露糖酶，與葡甘露糖酶共同作用，可分解原生質(zhì)；脫乙酰殼多糖酶，主要分解毛霉和根霉。 5. 5. 噬菌體產(chǎn)生的溶菌酶噬菌體產(chǎn)生的溶菌酶 該酶是一種特異性的酶，由噬菌體感染、誘導(dǎo)產(chǎn)生，但未被感染的宿主細(xì)胞上不存在該酶。 影響溶菌酶活性的因素影響溶菌酶活性的因素 1. 1. 溫度對(duì)溶菌酶活性的影響溫度對(duì)溶菌酶活性的影響 Weaver等發(fā)現(xiàn)在60以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等發(fā)現(xiàn)溶菌酶通過(guò)二硫鍵聚合，180時(shí)聚合和降解同時(shí)進(jìn)行，當(dāng)200時(shí)肽鍵的斷裂和重組發(fā)生，聚合和降解變得更為劇烈。Genentech和Genencor兩公司用遺傳工程的方法生產(chǎn)出一種改性T4溶菌酶，此酶中

10、有一個(gè)新的二硫鍵，這個(gè)鍵通過(guò)穩(wěn)定酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)而增加了溶菌酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性，使其在食品防腐方面更為有效。 Frasco等用紅外光譜研究了溶菌酶的熱變性機(jī)理，發(fā)現(xiàn)它是和水結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的。其它外側(cè)非極性氨基酸殘基對(duì)變性無(wú)重要影響，從外側(cè)極性氨基酸游離出的水在其始變性過(guò)程中起重要作用，水進(jìn)入內(nèi)部肽-肽鍵中，使蛋白質(zhì)膨脹和伸展。研究者們假定變性通過(guò)減少蛋白質(zhì)結(jié)晶化、增加整個(gè)表面積和可利用的極性水合位促進(jìn)水變構(gòu)，這使肽-肽鍵向肽-水鍵轉(zhuǎn)化，引起進(jìn)一步的蛋白膨脹和伸展，當(dāng)水加入體系時(shí)，其它水形成分子單層直至達(dá)到新加入的水不再影響蛋白電荷的層數(shù)為止。 2. pH2. pH對(duì)溶菌酶活性的影響對(duì)溶菌酶活性的影響

11、溶菌酶在酸性pH下是穩(wěn)定的，此時(shí)100的加熱對(duì)溶菌酶僅有很小的活性損失，Matsuoka等報(bào)道pH4.5（100、3min）、pH5.29（100，30min）的加熱溶菌酶是穩(wěn)定的。Beychok等報(bào)道溶菌酶在pH5.5最為穩(wěn)定，Cunningham等，Gorini等均發(fā)現(xiàn)溶菌酶在酸性時(shí)穩(wěn)定，在堿性時(shí)不穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果。 3. 3. 化學(xué)物質(zhì)對(duì)溶菌酶的影響化學(xué)物質(zhì)對(duì)溶菌酶的影響 Back等研究表明糖和聚烯烴類能增加溶菌酶的熱穩(wěn)定牲，Hidaka等發(fā)現(xiàn)NaCl對(duì)溶菌酶也有抗熱變性作用，同時(shí)Kravchenko等發(fā)現(xiàn)鹽溶液的存在對(duì)溶菌酶的活性是十分必要的， Chang的研究也發(fā)現(xiàn)溶菌酶的活性在低鹽濃

12、度時(shí)和離子強(qiáng)度密切相關(guān)的， 在高鹽濃度時(shí)溶菌酶的活性受到抑制， 陽(yáng)離子的價(jià)態(tài)愈高則其抑制作用愈強(qiáng)。Yashitake等發(fā)現(xiàn)具有-COOH和-SH3OH基的多糖對(duì)溶菌酶活性有抑制作用。 4. 4. 加工過(guò)程對(duì)溶菌酶活性的影響加工過(guò)程對(duì)溶菌酶活性的影響 Schaich發(fā)現(xiàn)溶菌酶和過(guò)氧化甲基亞油酸鹽一起培養(yǎng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度的下降和增加了溶解部分的分子量，Schaich等后來(lái)發(fā)現(xiàn)是由于在溶菌酶中產(chǎn)生了游離基，而導(dǎo)致其和過(guò)氧化的甲基亞油酸作用，研究表明溶菌酶中游離基濃度隨水活性的上升而下降，其原因可能是因?yàn)榛鶊F(tuán)的重構(gòu)和交換。Funes等繼續(xù)進(jìn)行溶菌酶和過(guò)氧化甲基亞油酸的作用研究，發(fā)現(xiàn)鐵在一個(gè)冷凍干燥的

13、模擬體系中溶菌酶在空氣中和過(guò)氧化甲基亞油酸作用，有聚合、生物活性損失和其它化學(xué)變化。Kanner等發(fā)現(xiàn)溶菌酶和過(guò)氧亞油酸的反應(yīng)生成了二聚和高聚體；多聚是因?yàn)殡S水活性增加共價(jià)鍵交聯(lián)度、蛋白質(zhì)不溶性和酶活性損失增加引起的。 .5 5 絡(luò)合作用對(duì)溶菌酶活性的影響絡(luò)合作用對(duì)溶菌酶活性的影響 溶菌酶可和許多物質(zhì)形成絡(luò)合物導(dǎo)致其活性喪失。Fleming等（1924）報(bào)道了等量蛋清和蛋黃的混合物其溶菌酶無(wú)活性，Hartsell報(bào)道脫水整蛋僅保留部分溶菌酶活性，Cunningoham等研究表明蛋黃在pH6.2磷酸鹽緩沖液中使純?nèi)芫甘Щ睿麄冇^察發(fā)現(xiàn)蛋黃污染蛋清僅有兩個(gè)離子交換色譜峰，而不是無(wú)污染的3個(gè)峰。P

14、arkinson報(bào)道了整蛋的色譜分離時(shí)無(wú)溶菌酶。研究者認(rèn)為抑制機(jī)理是在溶菌酶和蛋黃化合物間形成靜電相互作用的絡(luò)合物所致。N-乙酰葡萄糖胺的（1-4）鍵多聚物是溶菌酶的底物，它們間形成一聚、二聚、三聚、四聚體，是溶菌酶的抑制劑。Imoto分析了SDS和溶菌酶的相互作用，NMR、熒光和UV譜表明在沒(méi)有引起酶分子整個(gè)構(gòu)象變化的情況下它們之間形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。XRD分析表明SDS結(jié)合到活性位上強(qiáng)烈抑制了溶菌酶活性，除此之外其它和溶菌酶形成絡(luò)合物的物質(zhì)有：胸腺泡核、酵母泡核、甲狀腺素、甲狀腺球蛋白、-La、咪唑核吲哚衍生物。陽(yáng)離子如Co2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+等均可抑制溶菌酶的活性（10-31

15、0-2mol/l）。 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 .1 1 抗菌消炎抗菌消炎 溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性水解酶，此類粘多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一，該酶能催化水解細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，細(xì)菌內(nèi)容物逸出而使細(xì)胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽(yáng)性菌，在分泌型免疫球蛋白A、補(bǔ)體的參與下，還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等。此外，它還可與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，使其失活，并能增強(qiáng)抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的。 梁愛(ài)華（2001）考察在不同溫度下雞蛋清溶菌酶與-內(nèi)酰胺類抗

16、生素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)及內(nèi)毒素釋放的影響。結(jié)果：在不同的培養(yǎng)溫度下，氨芐西林或頭孢噻肟50 g/ml均可導(dǎo)致細(xì)菌溶解，并誘導(dǎo) Escherichia coli釋放大量的內(nèi)毒素到培養(yǎng)上清液中，這些培養(yǎng)上清液在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上可誘導(dǎo)大量的腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素6（IL-6）產(chǎn)生。而雞蛋清溶菌酶與-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用能阻止細(xì)菌溶解，降低細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放，并減少巨噬細(xì)胞TNF-和IL-6的產(chǎn)生。 2 2 抗病毒抗病毒 溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。該酶也可以預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為

17、顯著。在機(jī)體內(nèi)它還有抗流感病毒的活性，其與膽酸鹽的復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制流感病毒和腺病毒的生長(zhǎng)，并能防止皰疹性病毒感染。 3 3 增強(qiáng)免疫力增強(qiáng)免疫力 溶菌酶作為機(jī)體非特異免疫因子之一，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持機(jī)體生理平衡的重要作用?？筛纳坪驮鰪?qiáng)巨嗜細(xì)胞吞噬和消化功能，激活白細(xì)胞吞噬功能，并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。 4 4 其它方面的藥理作用其它方面的藥理作用 溶菌酶還具有激活血小板的功能，可以改善組織局部血液循環(huán)障礙，分泌膿液，增強(qiáng)局部防衛(wèi)功能，從而體現(xiàn)其止血、消腫等作用。它還可以作為一種宿主抵抗因子，對(duì)組織局部起保護(hù)作用。

18、2.5 促進(jìn)雙歧乳酸桿菌增殖 溶菌酶在嬰兒體內(nèi)可以直接或間接促進(jìn)嬰兒腸道細(xì)菌雙歧乳酸桿菌的增殖，促進(jìn)嬰兒消化吸收，可以促進(jìn)人工喂養(yǎng)嬰兒腸道細(xì)菌的正?；?；能夠加強(qiáng)血清滅菌蛋白（Properdin），-球蛋白（-globulin）等體內(nèi)防御因子對(duì)感染的抵抗力，特別對(duì)早產(chǎn)嬰兒有防御體重減輕、預(yù)防消化器官疾病、增進(jìn)體重等功效。 抗菌機(jī)理抗菌機(jī)理 細(xì)菌的細(xì)胞壁由胞壁質(zhì)組成，胞壁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine）及N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替組成的多聚物，胞壁酸殘基上可以連接多肽，稱為肽聚糖（Peptidoglycan）。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁

19、的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”（一般是4個(gè)氨基酸）組成，NAM與NAG通過(guò)-1，4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過(guò)-乳酰羧基連接在NAM第的3位碳原子上，肽尾之間通過(guò)肽“橋”（肽鍵或少數(shù)幾個(gè)氨基酸）連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為細(xì)胞壁的骨架，上述結(jié)構(gòu)中的任何化學(xué)鍵斷裂，皆能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，其水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子間的-1，4糖苷鍵，結(jié)果使細(xì)菌細(xì)胞壁變得松弛，失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，最后細(xì)胞溶解死亡。 溶菌酶的應(yīng)用溶菌酶的應(yīng)用 1 1 溶

20、菌酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用溶菌酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有多種藥理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效。溶菌酶首先適用于五官科各種炎癥。研究表明它對(duì)眼、耳、喉、口腔等的急、慢性炎癥均有一定療效。溶菌酶也可用于扁平疣、傳染性軟疣、尖銳濕疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。另外，人體溶菌酶濃度還可以作為多種疾病的診斷指標(biāo)。目前日本已生產(chǎn)出醫(yī)用溶菌酶，其適應(yīng)癥為出血、血尿、血痰和鼻炎等。 2 2 溶菌酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用溶菌酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 溶菌酶是一種無(wú)毒、無(wú)副作用的蛋白質(zhì)，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐劑。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；日本用15mg/kg溶菌酶用于低度酒的防腐，還可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時(shí)直接或間接地促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的增殖。溶菌酶殺菌防腐，由于不經(jīng)過(guò)加熱，屬于冷殺菌，因而避免了高溫殺菌對(duì)食品風(fēng)味的破壞作用，尤其對(duì)熱敏感的物質(zhì)更具有重要意義。此外，溶菌酶對(duì)人體安全、無(wú)毒、無(wú)害，且具有一定的保健作用。 3 3 溶菌