生物化學(xué)復(fù)習(xí)總結(jié).

1、學(xué)習(xí)必備歡迎下載1、探針的分類根據(jù)化學(xué)組成，可以將探針分為DNA 、 RNA 、 PNA 及寡核苷酸探針。DNA 探針這類探針應(yīng)用最廣，可以通過化學(xué)合成、克隆或PCR 技術(shù)獲得。RNA 探針一般用 RNA 聚合酶體外轉(zhuǎn)錄克隆的DNA 序列獲得。 RNA-RNA所有可能的雜交分子中最穩(wěn)定，但RNA 探針容易被RNase 降解。雜交分子在肽核苷酸 （PNA ）探針PNA 寡聚物是一類新分子，其結(jié)構(gòu)與DNA相似。但在PNA中，沒有核糖 -磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚酰胺）寡核苷酸探針它是根據(jù)探針靶序列的堿基順序用化學(xué)方法合成的單鏈DNA ，其長度為15-20 核苷酸。由于分子小，因此更容易滲

2、透到細胞的目標區(qū)域；但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團或報告分子數(shù)目，并最終導(dǎo)致雜交后熒光信號較弱。因此這類探針僅實用于對重復(fù)單位較短的高度重復(fù)序列的熒光原位雜交分析2、DNA 純化方法如果樣品中殘留的鹽和 SDS 的濃度過高：酒精 /NaAc 沉淀， 70%酒精洗如果樣品中殘留的 RNA 過多： RNA 酶 37C 半小時，酚 /氯仿去除 RNA 酶如果樣品中殘留的蛋白質(zhì)、酚過多：酚/氯仿去除3、DNA 濃度測定紫外分光法：1 OD 260= 50 g / mL ds DNA （雙鏈）= 40 g / mL ssDNA / RN （單鏈）計算舉例：15 L DNA 原液稀釋至3 m

3、l (200 倍), 測得 OD260 = 0.237,則DNA = 0.237× 50 × 200 = 2370 g / mL = 2.4 g / L點樣法：1 L 濃度未知的樣品和 1 L 已知濃度的標準品或上次實驗結(jié)果不錯的剩余 DNA 樣品分別與 9 L 溴乙錠 (10 mg / mL) 混合，紫外燈下目測二者的濃度差別，據(jù)此調(diào)整樣品濃度后，再點樣觀察，直至二者濃度基本一致。4、高通量測序技術(shù)的應(yīng)用重頭測序（ de novo sequencing）重測序（ resequencing）全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptome resequencing ）小

4、分子 RNA 測序（ small RNA sequencing ）染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）5、DNA 檢測應(yīng)用新藥研發(fā) 、個性化基因診斷 、癌癥診療、 產(chǎn)前診斷 、司法鑒定、 食品安全 、農(nóng)牧業(yè)研究 、環(huán)境保護、國防與軍事學(xué)習(xí)必備歡迎下載DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點：DNA 分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2nm，形成大溝-脫氧核糖 -磷酸 -為(major groove) 及小溝(minor groove)相間。堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對側(cè)堿基形成氫鍵配對（互補配對形式：相鄰堿基平面距離0.34nm，螺

5、旋一圈螺距3.4nm，一圈 10 對堿基。A=T; G C）6、重組 DNA 技術(shù)基本原理及步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組 DNA 分子導(dǎo)入受體細胞篩選并無性繁殖含重組分子的受體分子（轉(zhuǎn)化子）7、作為克隆載體最基本的要求是：具有自主復(fù)制能力，否則目的基因就無法進行克隆；攜帶易于篩選的選擇標記，用于篩選成功的重組DNA ，淘汰未重組的空載體；載體應(yīng)盡可能小，便于導(dǎo)入細胞和進行繁殖；使用安全。8、外源 DNA 導(dǎo)入宿主細胞將外源 DNA 導(dǎo)入宿主細胞是分子克隆的關(guān)鍵步驟之一。其導(dǎo)入方式是多種多樣的：外源 DNA 導(dǎo)入原核微生物細胞外源 DNA 通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染以及感染

6、等方式被導(dǎo)入原核生物細胞。、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 如果外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入原核細胞。無論轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染都需用氯化鈣處理宿主細胞，使其變得易于吸收外源DNA 的感受態(tài)細胞。、 噬菌體的體外包裝與感染如果外源 DNA 被包裝成 噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機制導(dǎo)入宿主細胞。體外包裝是將重組DNA 分子與 噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，從而組裝成完整具有感染力的噬菌體粒子?；驑?(微粒子轟擊法 )：是一種在高壓電極作用下，與微小金顆?；蜴u粉結(jié)合的DNA ，瞬間穿透細胞的細胞膜， 進入靶細胞、 組織和器官的基因轉(zhuǎn)移方法。微粒子進入細胞后， DNA逐漸從粒子中釋放

7、出來，開始表達。DNA 顯微注射：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法： 非病毒載體中最具代表性的是陽離子脂質(zhì)體(cationicliposome) ，它具有可自然降解、 無免疫原性等優(yōu)點， 已成為重要的體外基因轉(zhuǎn)移介質(zhì)。陽離子脂質(zhì)體通常由一個單一的陽離子兩親化合物和一個中性脂質(zhì)組成。陽離子脂質(zhì)體與DNA 通過靜電作用相結(jié)合，構(gòu)成脂質(zhì)體質(zhì)粒復(fù)合體。脂質(zhì)體質(zhì)粒復(fù)合體通過脂質(zhì)之間的相互作用，與靶細胞融合進入細胞內(nèi)，分解并釋放質(zhì)粒DNA ，最后 DNA 進入細胞核并在其中表達。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 :是以病毒為載體，將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒的遺傳物質(zhì)中， 通過這種重組病毒去感染受體宿主細胞，使外源目的基

8、因在宿主細胞內(nèi)表達。病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，大約70的治療方案采用了病毒載體，包括反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘苗病毒等。這些病毒載體有各自的特點，同時也存在各自的局限性。學(xué)習(xí)必備歡迎下載9、重組體的篩選與鑒定在構(gòu)建文庫之后就需要從眾多的克隆中，篩選出含有目的基因的重組體，并鑒定其正確性。這通常有三種鑒定方法：一是重組體表型特征的鑒定，二是重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定三是外源基因表達產(chǎn)物的鑒定。10、表達載體的構(gòu)建基因工程的主要目的是使外源基因能在細菌、酵母或動、 植物細胞中得到高效表達，以便獲得大量有益的基因表達產(chǎn)物或改變微生物或動、植物的遺傳性狀。所謂表

9、達載體 （ expression vector ）是指宿主細胞基因表達所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。也就是說， 克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內(nèi)擴增；表達載體不僅可使外源基因擴增，還可使其表達。表達系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件包括：啟動子、 核糖體的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止信號和密碼子偏愛性等。11、蛋白質(zhì)的紫外吸收色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含共軛雙鍵氨基酸的最大吸收峰在大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這幾種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法280 nm 附近。280nm 的光吸收值是分析12、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟蛋白質(zhì)的分離純化二硫鍵的拆分與保

10、護亞基分離多種方法的部分水解分離水解后得到的多肽測序重疊二硫鍵位置的確定13、蛋白質(zhì)間的相互作用力蛋白質(zhì)內(nèi)部：肽鍵蛋白質(zhì)間：非共價鍵、氫鍵、范德華力、疏水鍵、離子鍵14、同源異形結(jié)構(gòu)域（ Homeodomains，HD ）是一種編碼 60aa 的序列，長 180bp，它存在于很多控制果蠅早期發(fā)育基因中，在高等生物中也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基序。HD 的 C-端區(qū)域和原核阻遏蛋白的HTH 同源，但也有幾點不同:（1） HD 的 C 端由 3 個 -螺旋構(gòu)成，螺旋3 結(jié)合于大溝，長17aa；而阻遏蛋白由5 個 -螺旋構(gòu)成，螺旋3 長僅 9 個 aa；（2）原核的HTH 的以二聚體形式與DNA 結(jié)合，靶序列是回

11、文結(jié)構(gòu)，而HD是以單體形式學(xué)習(xí)必備歡迎下載與 DNA 結(jié)合，靶序列不是回文結(jié)構(gòu)；（3） HD N- 端的臂位于小溝，而HTH 螺旋 1 的末端與DNA 的背面接觸。15、蛋白質(zhì)和配基的結(jié)合甾類受體蛋白一般都具有3 個不同的功能區(qū)：（1） N- 端區(qū)是激活轉(zhuǎn)錄所需的區(qū)域，不同受體之間此區(qū)的同一性僅小于15%；（ 2） DNA 結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，同一性較高為94-42% ；（ 3） C-端的激素結(jié)合和二聚體形成區(qū)，同一性為57-15% 。16、生物大分子相互作用研究方法噬菌體展示酵母雙雜交技術(shù)免疫共沉淀染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)表面等離子共振熒光共振能量轉(zhuǎn)移串聯(lián)親和純化17、酵母雙雜交系統(tǒng)典型的真核生長轉(zhuǎn)

12、錄因子，如 GAL4 、 GCN4 、等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域: DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain) 。前者可識別 DNA 上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用， 啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。將編碼某一蛋白X 的 DNA 序列與 DNA 結(jié)合域 BD 的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白Y 的 DNA 序列與 DNA 激活域 AD 的編碼序列融合形成另一個雜交體，當(dāng)兩個雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA

13、結(jié)合位點的報告基因） ，若 X 和 Y 沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；若X 和 Y 可相互作用，則使BD 和 AD 靠近形成一個有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì) X 和 Y 的相互作用。用途：1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD 基因構(gòu)建成 “誘餌” 表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA 文庫與 AD 基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相

14、互作用的蛋白質(zhì)的cDNA 序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。優(yōu)點：1）蛋白 -蛋白相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。2）大規(guī)模篩選3）操作簡單，直觀（可以用熒光做報告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板篩選等）缺點：1）它并非對所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進入細胞核內(nèi)。因為融合蛋白相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在學(xué)習(xí)必備歡迎下載細胞核內(nèi)發(fā)生的。2）假陽性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認為是陽性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)

15、。3）在酵母菌株中大量表達外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用， 從而影響菌株生長和報告基因的表達。18、鹽析鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，其突出的優(yōu)點是： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用鹽析的操作方法：固體法、飽和溶液法、透析法19、有機溶劑沉淀法用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。有機溶劑的濃度和體積可按下式計算：V = V 0 (S2 S1)/(100 S2)式中： V = 需加入 100濃度有機溶劑的體積V 0 = 原溶液體積S1 = 原溶液中有

16、機溶劑的濃度S2 = 所要求達到的有機溶劑的濃度100 是指加入的有機溶劑濃度為100，如所加入的有機溶劑的濃度為95，上式的(100 S2) 項應(yīng)改為 (95 S2) 。20、選擇性變性沉淀法利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機溶劑變性等。21、有機聚合物沉淀法有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑， 最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。應(yīng)用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH

17、2OH(n 4)( Polyethylene Glycol簡寫為PEG ) 。在一定范圍內(nèi)，高分子量和濃度高的PEG 沉淀的效率高。優(yōu)點： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。 沉淀后有機聚合物容易去除。22、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-Rad Laboratories 生產(chǎn)，商品名為 Bio-Gel學(xué)習(xí)必備歡迎下載P，主要型號有 Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300 等限的 10 -3，數(shù)字越大，可分離

18、的分子量也就越大。10 種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻極限最大的Bio-Gel P-300 為 4× 105。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在pH 為 110 之間比較穩(wěn)定。在較強的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰胺凝膠易分解。聚丙烯酰胺凝膠非常親水，基本不帶電荷，吸附效應(yīng)較小。聚丙烯酰胺凝膠不象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。 聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物可能略有吸附作用，使用離子強度略高的洗脫液就可以避免。23、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖。瓊脂糖是由D半乳糖（ D-ga