石蠟切片免疫組化步驟

1、石蠟切片免疫組化步驟1. 石蠟切片放置在 60C恒溫箱中烘烤120分鐘。2. 脫蠟和水化：二甲苯 （20min） 二甲苯（20min） 無水乙醇（I0min）95吃醇（10min）90乙醇（10min）80%（10min）4. 抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液95度，10分鐘.（枸椽酸三鈉3g枸椽酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用 NaOH或HCI調(diào)pH值6.0,最后定容在1000ml）5. PBS浸洗2次各5min6. 加3%H2O2孚育5min（室溫或37度，避光）。肝組織過氧化物酶含量高。需增加濃度或增 長(zhǎng)時(shí)間。蒸儲(chǔ)水洗 2minx3次8. pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9. 與二抗

2、種屬一致的血清封閉非特異位點(diǎn)。（pv法不需要）9. 滴加一抗4C過夜10. PBS浸洗3次各5min11. 滴加二抗室溫或 37 C孵育30min12. PBS 洗 3 次各 5min15. DAB顯色520min,自來水充分涮洗16. 蘇木素復(fù)染23min,自來水充分涮洗17. 氨水反藍(lán)，過藍(lán)可用鹽酸酒精分化2s,自來水充分涮洗.用稀氨水返藍(lán)，自來水里加幾滴稀氨水，就行了，返藍(lán)時(shí)間5分鐘左右，就很好看了 ；淡氨水有人用50ml自來水+三四滴的氫氧化鉉；18.脫水、透明 80%(5min)90%(5min)95%(5min)100%(5min)100%(5min) 二甲苯(10min) 二甲苯

3、(10min)19.封片：中性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡），自然晾干二、操作流程1、脫蠟和水化脫蠟前，應(yīng)將組織芯片放在 60 C恒溫箱中烘烤2h以上，然后按以下流程進(jìn)行：二甲苯 I （1h）、二甲苯H （30min ）、100% 酒精（30min ）、95%酒精（15min ）、70%酒精（15min）、 50%酒精（15min ）、蒸彳留水（15min）2、3%H2O2，室溫封閉510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。3、甩去H2O2，蒸偕水洗2min X3次。4、抗原熱修復(fù)：將切片置于裝有抗原修復(fù)液的玻璃容器中（耐高溫），進(jìn)入微波爐內(nèi)，容器內(nèi)液體溫度達(dá)到95100C后斷電，連續(xù)

4、三次。15、PBS沖洗5min冷次。6、5%BSA封閉液20min ,甩去。7、用0.1mol/L PBS稀釋一抗100倍，滴加后4C過夜。8、 PBS 沖洗 2min X3 次，滴加二抗 37 C 20min , PBS 沖洗 2min X3 次，滴加 SABC 37 C 20min ,PBS沖洗5min X4次，顯色劑顯色。9、自來水沖洗，封片，觀察。|注意：如果需要做雙標(biāo)記法，則在操作完步驟8后，重復(fù)步驟38即可.評(píng)分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100% ）,最

5、終可以分?jǐn)?shù) 相加，再進(jìn)行比較。1. 1、方法操縱不難，最大的易處是出現(xiàn)非常后果時(shí)怎樣處理？這就需要把握免疫組化實(shí)行道理，每步曉得為何這樣做，這樣你才敢 斗膽地變革先前的不合錯(cuò)誤的方法步驟。如抗體孵育條件次要是 抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者通常為互相成反比的（相對(duì)），此中 濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應(yīng)的速率、時(shí)間決定反應(yīng) 的量。就拿溫度來講，可以有 4度、室溫、37度，我保舉4度最 好，反應(yīng)最暖和，背景較淺；而 37度反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短； 室溫我不太倡導(dǎo)，除非你每次都把情況溫度掌握在必然的范疇， 不然，盡可能選擇前兩者。2、免疫組化最大的上風(fēng)是定位和定性。比擬于其他蛋白檢測(cè)方法， 免

6、疫組化具有定性靈活度高、定位較直接正確，是定位檢測(cè)分析 尾選方法。特別對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有效。3、免疫組化結(jié)果定量分析的條件是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化 結(jié)果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情 況下，分析最為準(zhǔn)確，這種原則可能也是我們平常審稿時(shí)鑒定研 究結(jié)果的必備條件。4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)比通常為用必定表達(dá)這種抗原的切片來做；陰性對(duì)照一般是用 PBS或非 一抗替換一抗來進(jìn)行反應(yīng)，其他步驟均一致。前者是解除方法和 實(shí)驗(yàn)體系有無問題；后者是掃除有無一抗外的非特異性染色。5、免疫組化的應(yīng)用普遍，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的最重要方法之一?，F(xiàn) 在發(fā)SCI論

7、文時(shí)，顯著覺得僅靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難，加一 些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分接待，多是怕你學(xué)術(shù)造假吧。固 然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果。6、免疫組化技術(shù)掌握與否的審定尺度是同統(tǒng)統(tǒng)片或不同切片中不 同抗原均從摸索濃度或條件而做出良好的染色切片。我在日常平 凡帶教中就發(fā)現(xiàn)很多研究生把我已經(jīng)摸索很成生的反應(yīng)條件、濃 度、方法步驟，反復(fù)使用于同一性子的切片和同一種抗體，做出 來后就感覺本人已經(jīng)把握了免疫組化方法，調(diào)換一種抗體后，竟 然連二抗的種屬來源都拿錯(cuò)了。失利常常促進(jìn)你去思測(cè)驗(yàn)驗(yàn)原理和過程，樂成有時(shí)也加速你白負(fù)。1、觀點(diǎn)戰(zhàn)經(jīng)常使用辦法先容1、界說用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分

8、的漫 衍和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù) 稱為免疫組織化學(xué) （immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué) （immunocytochemistry）技術(shù)。2、原理按照抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色道理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗 本來和一抗結(jié)合，再操縱一抗與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟生物素、熒光素等 的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用符號(hào)辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸 酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過呈色反應(yīng) 或熒光來顯現(xiàn)細(xì)胞或組織中化學(xué)身分，在光學(xué)顯微鏡或熒鮮明微 鏡下可清楚瞥見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)品，從而可以在細(xì) 胞爬片或組織切片上原位肯定某些化學(xué)成

9、分的散布和含量。3、分類1）按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶 （主要有辣 根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒 光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多 步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提局了許多。3）按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶 （PAP）法；親和毗連，如蛋白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC） 法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶保持（SP）法等，個(gè)中SP法是 比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。

10、4、現(xiàn)在幾種常用免疫組化方法簡(jiǎn)樸引見1）免疫熒光方法是最早成立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它哄騙抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下考察。當(dāng)抗原抗體 復(fù)合物中的熒光素受激起光的照耀后即會(huì)收回一定波長(zhǎng)的熒光， 從而可肯定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由 于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)潔，所以在臨床病 理診斷、查驗(yàn)中利用較廣。2）免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60年月成長(zhǎng)起來的技術(shù)?；鶃?源根基理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后到場(chǎng)酶的 底物，天生有色的不溶性產(chǎn)品或具有一定電子密度的顆粒，通過

11、 光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞輪廓和細(xì)胞內(nèi)的各類抗原成分進(jìn)行定位研究。 免疫酶標(biāo)技術(shù)是今朝最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比 的主要長(zhǎng)處是：定位精確，比照度好，染色標(biāo)本可持久留存，合 適于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的開展十分敏捷，已經(jīng)衍生 出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的精益求精和立異，其特異性和 敏捷度都在不息提高，使用也愈來愈便當(dāng)。今朝在病理診斷中廣 為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。3）免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特別的金屬顆粒作為標(biāo)記 物。膠體金是指金的水溶膠，它能疾速而不變地吸附蛋白，對(duì)蛋 白的生物學(xué)活性則沒有顯著的影響。是以，用膠體金標(biāo)記一抗、 二

12、抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白） 等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至 定量研究。由于膠體金有不同巨細(xì)的顆粒，且膠體金的電子密度 高，所以避免疫膠體金技術(shù)分外得當(dāng)于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo) 記定位研究。由于膠體金本身呈濃至深白色，因此也適合進(jìn)行光 鏡窺察。如運(yùn)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法例更便于光鏡視察。5、被檢測(cè)的物資組織或細(xì)胞中但凡能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基 酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng) 的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。6、特性1）特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的根本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高 度特異性，因此，免疫組化從理論上講也

13、是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。 只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2）敏感性高。在利用免疫組化的肇端階段，由于手藝上的限定，只 有直接法、直接法等敏感性不高的手藝，當(dāng)時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；而今因?yàn)?ABC法或SP三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋 上千倍、上萬倍乃至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣 高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法愈來愈便利地運(yùn)用于 通例病理診斷事情。3）定位正確、形狀與功用相結(jié)合。該技能通過抗原抗體反應(yīng)及呈色 反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的精確定位，因此可同時(shí)對(duì)差 別抗原在統(tǒng)一組織或細(xì)胞

14、中進(jìn)行定位調(diào)查，這樣就能夠進(jìn)行形態(tài)與功效相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)范疇展開深切研究是非常成心義 的。7、從蛋白程度檢測(cè)角度，免疫組化技術(shù)與 Western blotting、ELISA 的異同1）Western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是操縱抗體抗原反應(yīng)原理， 結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能越發(fā)準(zhǔn)確；當(dāng)然Western blotting 也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白離別檢測(cè)其 中抗原含量，進(jìn)而間接反應(yīng)它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫 組化技術(shù)。2）ELISA :酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，也是使用抗體-抗原-抗原結(jié)合

15、反應(yīng) 原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù) 相比，定量最正確，是排泄性蛋白檢測(cè)首選方法之一。實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)介1、SP三步法1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi) 潴性過氧化物酶活性。3）蒸館水沖洗，PBS浸泡5分鐘4）候選步調(diào)：采取抗原建復(fù)：微波（發(fā)起30分鐘內(nèi)4次中水）、高 壓、酶修復(fù)要領(lǐng)。天然熱卻，再用 3分鐘冷次.5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡量與二抗來歷分歧。傾往，勿洗。6）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37C孵育23小時(shí)或4C過夜（最好 復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘X5次。7）滴加生物素標(biāo)志的二抗，室溫或

16、37C孵育30分鐘-1h。8）PBS沖洗，3分鐘X5次。9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37C孵育30分鐘-1h。10）PBS沖洗，3分鐘X5次。11）顯色劑顯色（DAB等）。12）白來水充裕沖洗。13）可進(jìn)止復(fù)染，脫水，通明。14）選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?、即用型二步法1）脫蠟、水化組織切片。2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的非凡要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處置。3）0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過 氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或37C孵育3060分鐘，或4C留宿，PBS或 TBS浸洗3分鐘X5次。5）滴加enhangcer加強(qiáng)劑，37度30

17、min, PBS或TBS浸洗3分鐘X5 次。6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37C孵育30分 鐘-1h, PBS/TBS7中洗，3分鐘X5次。7）應(yīng)用DAB溶液顯色。8）蒸館水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。3、免疫熒光技術(shù)（略）樞紐環(huán)節(jié)分解（較前有所更新）1、酶免疫組化的環(huán)節(jié)環(huán)節(jié)1）標(biāo)本固定：固定的目的是防止標(biāo)本從玻片上脫落； 除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于取得杰出的染色結(jié) 果；固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用 Bouin's液或mDF液效果較好。2）脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）

18、充分脫水、 對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和厲害。否則，容易裂片 和脫片等。3）脫蠟和水化：這是為了前面的抗體等試劑可以或許充實(shí)與組織中抗原等結(jié)合反映。脫蠟可以先 60度20min,然后當(dāng)即二甲苯1-3 別離10min（這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新穎水平和室溫等綜開決議的 ）， 但當(dāng)天造好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。 若脫蠟和shui化不全易出現(xiàn)局灶性回響反映和浸洗不齊，而產(chǎn)生 非特異性后臺(tái)著色。4）抗原修復(fù)：因?yàn)榻M織中部門抗原在甲醛或多散甲醛牢固進(jìn)程中， 發(fā)作了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉感化，從而落空抗原性；通過 抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決意族從頭表露，進(jìn)步抗原檢測(cè)率。

19、 常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、 胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為多少種（詳細(xì)的可以查閱相干材料，年夜 量的：中性的、高 pH的等）。我們實(shí)行室一般用微波修復(fù)中火 6min*4次，效果不錯(cuò)。留意微波修復(fù)后天然冷卻30min閣下（只要 你感覺修復(fù)液的溫度達(dá)室溫便可）。5）細(xì)胞通透：目標(biāo)是使抗體可以或許充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可 以消融細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子 構(gòu)造的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為保舉使 用，這樣抗體就可以順?biāo)爝M(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織 化

20、學(xué)（10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton X-100作為細(xì) 胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在PBS中插足后終濃度是0.05%即可，而前者末濃度是 0.5%-1%。石蠟切片 4um左左可以欠亨透，因?yàn)榧?xì)胞曾經(jīng)被切開了。6）滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的 ABC法和SP法中， 免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易支到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD 一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可 以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般 1030min;用甲醇配置過氧化氫比雙 蒸水或PBS可能好在回護(hù)抗原和固定組織

21、作用，過氧化氫孵育時(shí) 間過長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4度避光保存。不過，目 下當(dāng)今已有"第二代即用型免疫組化試劑盒"避免內(nèi)源性生物素的 干擾，引薦使用。7）血清封閉：組織切片上有盈余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合， 造成后絕結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來歷的，血 清中動(dòng)物本身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié) 合；也能夠用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及與一抗來 源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過分8）一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包羅孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37

22、度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗 體濃度有關(guān)，一般37度1-2h,而4度過夜和從冰箱拿出后37度 復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37度30min-1h,具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是 濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群?孵育時(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反 應(yīng)在4度最佳，反應(yīng)溫文，但時(shí)間最好超過 1624h。9）抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除 PBS成分外，還加了疊氮化鈉防腐劑、 BSA穩(wěn)定劑等組份，反抗體的多次收受接管行使較好。正因?yàn)檫@ 種原因，

23、我一向用國(guó)產(chǎn)的公用抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提醒可能一抗沒有結(jié)合），最 后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗 體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性 結(jié)果。10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘 留而引起非特異性染色，以是適本地增強(qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增屢次數(shù)）尤其重要，我一般在一 抗孵育前的洗濯是 3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。留意：?jiǎn)为?dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。溫順沖洗， 防止切片的脫落。我喜好用浸洗方法；沖洗的時(shí)間要充足，才 氣完全洗來結(jié)合的物資。PBS的PH和離子

24、強(qiáng)度的運(yùn)用和要供。這方面我有慘重教導(dǎo)，其時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，成績(jī)配景一 片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性 及弱石僉性條件（PH7-8）有益于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有 利于剖析；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度 則有利于合成）11）DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，首要由顯微鏡下節(jié)制顯 色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB 顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這極可能說 明你的抗體濃度太高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或 縮短你

25、的抗體孵育時(shí)間；另外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還 有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全， 需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB 顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如跨越十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明 你的抗體濃度太低或孵育時(shí)間太短（最好一抗4度過夜）；另一方面 就是封閉時(shí)間過長(zhǎng)。12）復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位， 常常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室 溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒 -數(shù)分鐘，胞 漿蛋白可以適事先間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過這個(gè)如果 染色不睬想可以彌補(bǔ)的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒

26、精是分化，氨水是返 蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù) 秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。13）封片：為了歷久保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生 機(jī)泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住 蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的誰人拐角，接近封片液近真?zhèn)€ 拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在接續(xù) 彌散時(shí)，則可以遲緩降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1）冰凍切片制備：建議用新陳組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部布局粉碎， 易使抗原彌散。選用潔凈尖利的刀片、組織必定要冷凍適度等， 防止裂片和脫片寬重。2）組織

27、切片固定：切好片風(fēng)干后立刻用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定 5-10min,尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要實(shí)時(shí)固定和適當(dāng)保 存。3）血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合， 需要在一抗 孵育前先用血清（與二抗起原同等）封閉，削弱背景著色。血清封閉 的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般 10-30min。4）一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包孕孵育時(shí)間和抗體 濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，個(gè)中4度效果 最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有閉，一般 37度1-2h,而 4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要試探。5）二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37度30min-1h,

28、具體時(shí)間需要 摸索，而濃度一般有工作液，如果稀釋液還要摸索濃度，切紀(jì)要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先 定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。最后，熒光素標(biāo)記的二 抗跟著生存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要 注重配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x古道熱腸。6）復(fù)染：目標(biāo)是形成細(xì)胞表面，從而更好地對(duì)方針蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7）封片：為了恒久保存，我們一般用緩沖苦油等封片，此外還有專 門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)活力泡，方法是直接在載玻片組 織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一腳拿劈面的阿誰拐角，靠近封片液遠(yuǎn)真?zhèn)€拐角先降低，直至接觸到液體

29、 時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體打仗面在不休彌散時(shí)，則可以遲緩降低另一 拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)氣憤泡。8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)）尤為重要，我一般在一 抗孵育前的清洗是 3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗， 防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才 能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗 體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在 7.4-7.6濃度是0.01M。（中

30、性及弱檢隹條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合 物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù) 合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）9）攝影：有條件的話最好當(dāng)即拍照，若不能實(shí)時(shí)照相，也要封好片 和用指甲油封固，連結(jié)避光和干度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)酷依 照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨便改動(dòng)法式；應(yīng) 在暗室中進(jìn)行查抄；防止紫外線對(duì)眼睛的侵害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；搜檢時(shí)間每次以12h為好，凌駕90min,超高壓 汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐步降落，熒光削弱；標(biāo)本受紫外線映照35min后, 熒光也明明減弱或退色；激起光長(zhǎng)時(shí)間的照耀，會(huì)發(fā)生熒光的衰加和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過 23h;熒

31、鮮明微鏡光源壽命有 限，標(biāo)本應(yīng)集合搜檢，以節(jié)流時(shí)間，庇護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加風(fēng) 扇散熱降溫，新?lián)Q燈膽應(yīng)從最先就記實(shí)使用時(shí)間。燈燃燒后欲再 啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次撲滅 光源。封閉汞燈最少在開啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀測(cè)， 因時(shí)間暫了熒光會(huì)逐步減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4C保 存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體， 都必須厚度勻稱，無顯明的白覺熒光，如果使用油鏡，還必須包 管鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不但會(huì) 降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。3、免疫組化和免疫熒光成果闡明：見第一場(chǎng)實(shí)驗(yàn)講座。案例一 DAB染色后

32、切片著色一片黃/背景深 背景：奧運(yùn)會(huì)時(shí)代我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京采 辦的試劑買不到，對(duì)我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前 一向用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì)時(shí) 期我籌辦做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，第一批組化實(shí) 驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感受比較符合（Santa Cruz公司1: 200）,等 做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順?biāo)爝M(jìn)行，我又 從禍州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，我又 從新從專士德公司買了一小瓶 10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開端，組化實(shí) 驗(yàn)結(jié)果不斷顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難分辨。問題及其解 答：產(chǎn)生組織切片非

33、特異性染色的原因有哪些 ？如何解決？1、抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮 短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體 看看。3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血 細(xì)胞多的組織），需要通過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低 背景染色；4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免 疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；5、DAB孵育時(shí)間過長(zhǎng)或濃度太高；6、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果加強(qiáng)著色，在一抗 /二抗/SP孵 育后的浸洗尤為重要；7、標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出

34、現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。 我的實(shí)踐解決方案：以上的剖析可能對(duì)付初學(xué)者仍是不簡(jiǎn)單的，上面我就把我的清掃 嘗試的具體過程與各人進(jìn)行分享、交換和會(huì)商。1、起首清除抗體孵育條件。一般來講，著色效果的黑白與抗體的孵育條件是稀弗成分的，由于用SP法已做出來過一次且效果不錯(cuò)， 因而對(duì)于一樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先清掃。2、其次，DAB孵育時(shí)候是不是太少？做出去那一次我是孵育8min, 厥后也是8-10min,我零丁做了一次嘗試來解除該身分。 成果孵育2、5min時(shí)先泛起布景，而特異性染色較淺，故那沒有契合常理， 普通先出現(xiàn)特同性染色，然后跟著工夫的耽誤，會(huì)呈現(xiàn)非特同性 后臺(tái)著色。3、最

35、后，血清封閉的問題？從前我一般孵育15-30min,所以我單 獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫 1h,其它條件同做出來的那一次， 結(jié)果也一樣背景著色很深。4、此外，我在改良的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不竭地延長(zhǎng)時(shí)間和增加 次數(shù)，乃至完全參照試劑盒仿單來進(jìn)行操作（我之前一般一抗4度 過夜且室溫復(fù)溫 45min、二抗37度30min、SP反應(yīng)37度30min）, 和過氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。我沉著地分析了一下整 個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與第一次做出來比擬，只有兩個(gè)處所做了竄改：因血清不敷而改換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而從頭買 了抗體稀釋液。5、我用PBS替換一抗稀釋液（我之前借收受接管抗體，白我以為

36、抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白不變劑），別的步調(diào)和組織切片完整 與第一次做出來的一致（包羅血清也是老試劑盒內(nèi)殘剩的一點(diǎn)），古 跡出現(xiàn)了 ：成效很好。-由于抗原抗體反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃 度中，然后就是PH值，因而我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液 和PBS的PH值，了局是前者偏酸性（6、0）,然后二者均在7、5 閣下。6、看來重要禍端是抗體稀釋液的 PH值出問題了，因而我又用PBS 替換抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，效果照舊沒有做出來：背景很深。這實(shí)把我搞慘了。莫非另有什 么緣故原由嗎？通過細(xì)心分析：一抗必然是結(jié)合上去了 （老SP試劑 盒結(jié)果很好），題目是二抗沒有結(jié)合上去也差

37、池 （因?yàn)樽詈蟊尘昂?深，這闡明二抗可能也結(jié)合上去了 ），DAB孵育時(shí)間此刻只用1、 5min也是背景深而特異性染色淺，那我又思疑封閉血清了。7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，別的試劑（二抗、SP）均用新試劑盒供 給的，結(jié)果是前一張效果很好，爾后一張能夠看到特異性染色， 但背景太深，拍照效果欠安。-看來封閉血清也是功會(huì)罪魁之一。結(jié)果分析表現(xiàn)：抗體稀釋液的 PH值偏低和封閉血清的shi效導(dǎo)致 了我的免疫組化結(jié)果的不佳，看大師在今后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注 意這兩個(gè)不太惹人注意的要害問題。-凄慘的教訓(xùn)，值得引覺得鑒。案例二DAB染色后切片著色呈陽性后果背

38、景：實(shí)在免疫組化在DAB染色后一般有四種情形：陽性染色效果很好、 陰性染色、非特異性染色很深、陰陽臉（染色不平均）。而陰性染色 是很多初學(xué)者常常碰到的頭痛問題。我身旁有個(gè)研討生同窗在我 們真驗(yàn)室初度涉入免疫組化，傳聞步驟不難，跟我背面做了幾回 以后，就本身起頭做了，持續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。彳艮 失望，不知是什么緣由招致的。問題及其解問：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些 ？1、抗體濃度和質(zhì)量問題和抗體來源選擇毛病。不知抗體是入口的 照樣國(guó)產(chǎn)的工作液，怎樣這么局稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果？另外，不是抗體濃度越周就越易 出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必需探索最佳 濃度。2、抗原

39、修復(fù)不全，對(duì)甲醛固定的組織必需用充分抗原修復(fù)來翻開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min嘗嘗。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不可，還可高壓修復(fù)。3、組織切片白己這種抗原含量低；4、血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。5、DAB孵育時(shí)間過短。6、細(xì)胞通透不全，抗體已能充實(shí)進(jìn)進(jìn)胞內(nèi)介入反應(yīng)。7、入手下手做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片， 排除抗體等外的方法問題。我的現(xiàn)實(shí)辦理計(jì)劃：1、起首，破除組織切片內(nèi)的抗原有沒有喪失及其含量幾多。免疫 組化中兩個(gè)最緊張的身分是抗原和抗體。（1）抗原有沒有丟得首要 看組織切片的奇怪水平，一般切片室溫保留超越3-6個(gè)月，可能切 片內(nèi)的抗原丟掉

40、很嚴(yán)峻（有文獻(xiàn)撐持），此時(shí)可以通太重新用白臘塊 切片來進(jìn)一步考證（蠟塊需要高溫留存）。（2）白臘切片在建造歷程中 大概果醛基對(duì)立原決定族的封閉，這需要通過抗原修復(fù)來充裕露出，從而刪加抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，提高陽性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù)，用枸椽酸鈉緩沖液。（3）組織切片中白己抗原含量的幾？這方面我有經(jīng)驗(yàn)的，我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞判定，用 1: 200 一抗效果很好；但我用1: 200 一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞 檢測(cè)，幾近呈陰性，后來證明是由于二者抗原含量相差甚近，則 一抗也要適當(dāng)進(jìn)步濃度。2、 其次，檢查抗體有無選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件能否不適。 一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果，因

41、為靈敏度低但特異性好； 一抗的species reactivity中無檢測(cè)組織的種屬，這是比較常見的錯(cuò) 誤；一抗選擇rat,而二抗是抗 mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性 結(jié)果。（2）抗體孵育時(shí)間過短，容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建 議4度孵育過夜和37度復(fù)溫45min;二抗我一般37度30min。我 不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。（3）抗體濃度過低。這是陰性 結(jié)果的最可能原因。必須提高稀釋度，我一般首次做一種新抗體， 必須先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高 照樣低標(biāo)的目的摸索。一般先決定二抗的濃度 （工作液就好辦了， 直接滴加），重點(diǎn)摸索一抗的最適濃度。注意：免疫

42、反應(yīng)中存在前 帶和后帶效應(yīng)，這提醒不是濃度越局，陽性率就越局，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要無視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一般比 較穩(wěn)固，效果較好；而入口分裝次之；工作液可能要注意質(zhì)量問 題。3、同時(shí)，DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng)，在鏡下察看， 偶然可 延長(zhǎng)至30min。但一般3-10m in最好,此時(shí)背景也較淺?？蓜t， 申明抗體濃度不適宜。4、最初，血渾封閉時(shí)間也可響應(yīng)縮短。一般 10-30min,但這個(gè)時(shí) 間可以調(diào)解，啟閉主如果下降切片的整體配景著色。5、此外，細(xì)胞通透也不成輕忽。很多戰(zhàn)友以為石蠟切片一般不需 細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了，但對(duì)于胞核蛋白， 建議照舊通透一

43、下，增進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入到場(chǎng)反應(yīng)。6、以上原因，都是針對(duì)現(xiàn)實(shí)中常見原因來進(jìn)行分析的，條件是排 除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果，這就需要新手仍是要設(shè)置陽性對(duì)照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它 原因的滋擾?？傊?，要想把免疫組化做好，可能每個(gè)環(huán)節(jié)都很重 要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問題了，需要通過先排除主要的， 再順次排除主要的-這是權(quán)衡你對(duì)免疫組化原理把握與否的樞紐 地點(diǎn)。案例三石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果背景：因?qū)嶒?yàn)需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1（ 一種胞 膜蛋白，慎密毗鄰蛋白）免疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化很是 熟習(xí)，在園子內(nèi)也有很多

44、置頂貼和精髓帖，但免疫熒光一直還沒 做過（原理知道，但細(xì)節(jié)不太認(rèn)識(shí)）。我先用石蠟切片做了 5次，結(jié) 果不停不幻想（表示為未見特異性強(qiáng)染色）；近幾日，我又切了冰凍 切片，做了 2次，終究根基成功了。在這個(gè)過程中，我對(duì)免疫熒 光染色技術(shù)有了全新的熟悉，而前些天發(fā)出免疫熒光乞助揭，答 復(fù)的很少，所以有需要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的計(jì)議 )，不當(dāng)?shù)牡胤?敬請(qǐng)斧正。有人會(huì)問酶免疫組化做的好好的，為什么要做免疫熒 光?其實(shí)，這也是我以前思慮的困難，如今我認(rèn)為可能胞膜蛋白含 量不高，用通俗免疫免疫組化可能做不出來，需要敏感的免疫熒 光方法來進(jìn)行蛋白檢測(cè)(我是看許多外文文獻(xiàn)都是這樣做的，因此 選擇免疫熒光染色。)問

45、題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色？1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案：(1) 游離熒光素殘留在二抗中。一部門熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形 成了聚合物和衍化物，而不克不及被透析除去。二抗設(shè)置裝備擺 設(shè)時(shí)用透析法或?qū)游龇▌e離熒光素符號(hào)的二抗和游離的二抗。購(gòu) 置高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。(2) 抗體之外的血清蛋黑與熒光素連系構(gòu)成熒光素脈卵白，可與組 織成份分離。(3) 組織抗原封閉不全。撤除查抄的抗原之外，組織中還可能存在 類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原之外之之 響應(yīng)抗體結(jié)合。延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間。(4) 從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中常常

46、混 同一些抗其他組織成分的抗體，乃至容易混合。(5) 抗體分子上標(biāo)志的熒光素份子太多，這類過量標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的 抗體分子帶過量的陽離子，可吸附于一般組織上而顯現(xiàn)非特異性 染色。(6) 熒光素不雜、標(biāo)本流動(dòng)不妥等。(7) 一抗和二抗孵育前提和濃度分歧適。調(diào)劑一抗和二抗孵育條件 和濃度至最好。(8) 一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)清洗時(shí) 間。2、陰性染色產(chǎn)生的緣由有：(1) 一抗和二抗?jié)舛炔贿m合或孵育前提不當(dāng)。(2) 熒光素提早闌珊。熒光本質(zhì)量欠安或操縱過程當(dāng)中出有留意躲光等避免熒光素闌珊的事項(xiàng)。血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。(4) 抗體稀釋液PH值分歧適，影響抗原抗體反應(yīng)。(5) 組織切片不

47、服、裂片或脫片很嚴(yán)重，易引起大塊陰性著色。(6) 組織標(biāo)本不新穎或已冷凍組織制成的切片中抗原易彌集，易引 發(fā)原本表達(dá)的部位陰性染色或弱著色。(7) 熒光顯微鏡不會(huì)使用，引發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。已有的常見免疫組化困難散錦1、石蠟切片和冰凍切片的比較？(1) 要求做冰凍切片的紛歧定能做石蠟切片，這是明天我背一教員 就教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)毀壞組 織的抗原性，假如組織的抗原性較不亂，則可作石蠟切片；然則 要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。(2) 冰凍切片的劣點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免 疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。錯(cuò)誤謬誤是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而 破損細(xì)胞布局，可能會(huì)使抗

48、原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的 片子沒石蠟的標(biāo)致。當(dāng)你買一抗時(shí)，目次上都寫著做什么樣的切 片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可， 那就都能做。(3) 石蠟切片的長(zhǎng)處可以連結(jié)組織細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造，且容易寄存在室溫，而冰凍切片對(duì)照費(fèi)事，一定要存在-80度的低溫冰箱中，特 別是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保留一向很重要。由于石蠟切片可以切到 4微米擺布，所以原位純交探針容 易滲入到組織中去，輕易勝利，并且得到的色彩 /形態(tài)都較冰凍切 片好。2、一抗的選摘要點(diǎn)和技能是甚么？(1) 單克隆和多克隆抗體的挑選。由一種克隆發(fā)生的特異性抗體叫 做單克隆抗體。單克隆抗體能方針明

49、白地取單一的特異抗原決議 簇連系，就像導(dǎo)彈切確天射中目的一樣。另外一方面，即便是統(tǒng) 一個(gè)抗本決意簇，在機(jī)體內(nèi)也能夠由好幾種克隆來發(fā)生抗體，構(gòu) 成好幾種單克隆抗體稠濁物，稱為多克隆抗體。正在抗原抗體反 響中，一樣平常單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗 原活絡(luò)度相對(duì)便低；而多克隆抗體特異性稍強(qiáng)，但抗體的親和力強(qiáng)，活絡(luò)度下，但易出現(xiàn)非特異性染色(能夠經(jīng)由過程封鎖等制止)。(2) 使用規(guī)模的選擇。有的一抗只能用于 Western blotting ,或免疫 組化、免疫熒光、免疫沉淀等；以至講明石蠟切片或冰凍切片。(3) 種屬反應(yīng)性的選擇(species reactivity)。這一點(diǎn)很重要，表

50、白這類 抗體可能存在種屬差異，且這種抗體合適檢測(cè)哪一種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。(4) 種屬起原，一般兔濫觴的多是多克?。欢∈笕吹亩嗍菃慰?隆，但也有別的。憑據(jù)此根源來選擇相應(yīng)的二抗。(5) 出產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價(jià)錢2100 元左右；而chemicon公司一抗一般100ul,價(jià)錢2800元左右。這 兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)不亂是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做 Western blotting效果還可 以。3、在甚么環(huán)境下利用TritonX-100?(1) Triton X-100化學(xué)稱號(hào)為聚乙二醇辛基苯基酬，是一種去污劑。在免疫

51、組織化學(xué)(10um薄切片)和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton X-100作為細(xì)胞通透劑， 在膜上挨孔。(2) 其作用原理：Triton X-100可以消融細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器 膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故 在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能逆利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。(3) Triton X-100既是一種概況活性劑，也有抗氧化作用，具體參 閱：、封閉血清的選擇原則是什么？(1) 膜上或切片上有殘剩的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù) 結(jié)果的假陽性！(2) 封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物本身的抗體， 預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，

52、否則在后面的步驟 中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。(3) 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、抗體孵育條件的比力？(1) 一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，此中4度效果最佳； 孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度1-2h,而4度過 夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。(2) 二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時(shí)間需要摸索。6、一抗4度孵育后為何要進(jìn)行37度復(fù)溫？一圓里，防備切片從4度間接放進(jìn)PBS易脫片；(2) 另一方面，使抗原抗體結(jié)合更波動(dòng)。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱 的抗原可能有效，4度和37度時(shí)分子活動(dòng)體式格局不同，前者分子碰 碰機(jī)率和

53、活動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并 易造成非特異染色。(3) 實(shí)在，我更附和后一種道法，因?yàn)槲覝y(cè)驗(yàn)考試把肝臟或睪丸電 影從4渡過夜拿出后，曲接用PBS洗沒收生過脫片征象。究竟勝 于雄辯！7、DAB顯色時(shí)間如何掌控？(1) DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，至V 出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這 很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵 育時(shí)間；(3) 此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非 特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如跨越十幾

54、分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，一方面 能夠申明您的抗體濃度土低或孵育時(shí)間太短(最好一抗4度留宿)； 另外一方面就是封閉時(shí)間太長(zhǎng)。8、免疫組化成績(jī)?nèi)艉侮U發(fā)？(1) 陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不堆疊的10個(gè) 視家，野生或機(jī)械計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組 36張不同動(dòng)物組織 切片，然落后行組間比擬即可。(2) 灰密度分析法。通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇溝 通地區(qū)、不異條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析即可。(3) 評(píng)分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片劃分按染色程度 (03 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽性局限進(jìn)行評(píng)分(14 分為 025%、2650%、

55、5175%、76100%),終究可以分?jǐn)?shù)相加，再舉行對(duì)照。關(guān)于以上這幾種方法，各有益 弊，請(qǐng)仔細(xì)選擇。要念獲得準(zhǔn)確效果的條件是你要做出著色平均、 靠山很淺的高質(zhì)量切片。9、 在什么環(huán)境下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？(1) 由于組織中部份抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋 白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而落空抗原性。通過抗原修復(fù)， 使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族從新表露，提高抗原檢測(cè)率。(2) 修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶 修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種(具體的可以查閱相干資料，大量的： 中性的、高pH的等)。(3) 微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，結(jié)果不錯(cuò)。10

56、、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么 ？一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短面，可以10min擺布；而0.3%過 氧化氫則可以恰當(dāng)?shù)⒄`關(guān)閉時(shí)間，一般 1030min。(2) 用甲醇設(shè)置過氧化氫比單蒸水或 PBS可能好在護(hù)衛(wèi)抗原和固定 組織作用，過氧化氫孵育時(shí)間過長(zhǎng)易引起脫片.(3) 現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脫蠟？(1) 蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少量蠟存留于切片上，將會(huì)引 發(fā)染色不均勻、陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為領(lǐng)會(huì)決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫 蠟的試劑主如果二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；(2) 脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季候，室平和試劑

57、的新鮮碰面是在不同。若是在炎天，室溫較局，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需許多，3-5分鐘就已足夠。假如在冬季，室溫較低，脫蠟試劑也較陳腐， 則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20分鐘或更長(zhǎng)。(3) 當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫 蠟這將可加快脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前， 還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度 放慢，效果魁梧更好?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的時(shí)節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決 定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、清潔、完全地脫去切片上的 蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色 ？(1) 收縮一抗/兩抗孵育時(shí)間、密釋抗體來節(jié)制。這是最主要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，倡議試用單克隆抗體 看看。(3) 內(nèi)源性過氧化物酶和死物素在肝凈、腎臟等構(gòu)造露量很高(含血 細(xì)胞多的組織)，需求經(jīng)由過程延伸滅活時(shí)間和增添滅活劑濃度來低落布景染色；(4) 非特異性組分與抗體聯(lián)合，這必要經(jīng)過延長(zhǎng)二抗濫觴的植物免