食品分析-色譜分析講義資料

1、.第二部分 色譜分析第二部分 色譜分析第一章薄層色譜法（TLC）一 薄層色譜法概述薄層色譜法是一種基于混合物組分在固定相和流動相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法。與HPLC不同，TLC將固定相涂鋪在栽板上，使之形成均勻的薄層。被分離的樣品溶液點加在薄層板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流動相（深度約5mm）的密閉缸中，進(jìn)行色譜展開，實現(xiàn)混合組分分離。被展開的組分斑點即色譜譜帶，通過適當(dāng)技術(shù)對色譜譜帶進(jìn)行處理可得到定性和定量的檢測結(jié)果。薄層色譜法具有技術(shù)比較簡單，操作容易，分析速度快，高分辨能力，結(jié)果直觀，不需昂貴儀器設(shè)備就可以分離較復(fù)雜混合物等特點。二 薄層色譜法中的薄層板、薄層板的涂鋪

2、、點樣和展開（一）薄層板TLC分離的選擇性主要取決于固定相的化學(xué)組成及其表面的化學(xué)性質(zhì)?？赏ㄟ^改變涂層材料的化學(xué)組成或?qū)Σ牧媳砻孢M(jìn)行化學(xué)改性來實現(xiàn)改變薄層色譜分離的選擇性。此外，固定相的物理性質(zhì)，如比表面積、比空容、平均孔徑等也對其色譜行為產(chǎn)生影響。（1）載體 對TLC載體的基本要求為：機械強度好、化學(xué)惰性好（對溶劑、顯色劑等）、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻、價格適宜。（2）固定相 TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相兩類。硅膠和氧化鋁是最常用的兩種未改性固定相。（3）粘合劑 在制備薄層板時，一般需在吸附劑中加入適量粘合劑，其目的是使吸附劑顆粒之間相互粘附并使吸附劑薄層緊密的附著在載板上

3、。常用的粘合劑可分為無機粘合劑和有機粘合劑兩類。（4）熒光指示劑 熒光指示劑是便于在薄層色譜圖上對一些基本化合物斑點（無顏色斑點、無特征紫外吸收斑點）定位的試劑。加入熒光指示劑后，可以使這些化合物斑點在激發(fā)光波照射下顯出清晰的熒光，便于檢測。（二）薄層板的涂鋪涂板方法可以分為涂布法、傾注法、噴灑法及浸漬法四類，其中涂布法是應(yīng)用最廣泛的涂板方法。TLC固定相薄層涂鋪大多采用濕法勻漿，要求薄層均勻、平整、無氣泡、不易造成凹坑和龜裂。薄層板活化處理可以獲得適宜活性，提高色譜分離效率和選擇性。（三）點樣點樣是TLC分離和精確定量的關(guān)鍵。不同種類的樣品常需選用不同的配樣溶劑，一般采用易揮發(fā)的非極性或弱極

4、性溶劑配樣。離子型化合物樣品，常需先衍生化成在揮發(fā)性強、極性小的溶劑中易溶解的樣品衍生物。最適合點樣的樣品濃度應(yīng)為（15）g·L-1，點樣體積視點樣技術(shù)不同而異。TLC定量分析時，樣品量的適宜范圍為最小檢出量的幾倍至幾十倍。樣品原點一般在1mm左右為佳，原點過大或樣品量過大，會導(dǎo)致分離變壞。點樣步驟一般占TLC全部分析時間的三分之一左右，所以使點樣儀器化、自動化，既快又準(zhǔn)，獲得好的重復(fù)性，是TLC工作者所期盼的。（四）展開TLC展開就是流動相沿薄層（固定相）運動，以實現(xiàn)樣品混合組分分離的過程。這一過程需在具有一定形狀的展開室中進(jìn)行。薄層展開有三種形式，直線式展開方式為實際應(yīng)用中使用最

5、普遍的展開方式。三 薄層色譜流動相與展開機制（一）對流動相溶劑選擇的基本考慮薄層色譜溶劑的選擇對分離的影響很大。與HPLC同理，對復(fù)雜樣品的分離能否得到理想的結(jié)果，流動相的選擇是最重要的因素之一，不同溶質(zhì)與流動相分子、固定相分子間的作用力不同，因此其移動速度也不同，最終導(dǎo)致樣品中各組分的分離。對流動相的選擇不僅需考慮極性、選擇性等因素，更基本的應(yīng)注意以下因素的影響：(1)溶劑純度，含有雜質(zhì)影響分離。(2)溶劑吸收環(huán)境水分，會使極性等性質(zhì)改變。(3)存放條件不適宜或貯存時間過長，溶劑會變性。(4)混合流動相之間發(fā)生作用會使溶劑性質(zhì)改變。溶劑極易揮發(fā)，流動相組成隨時改變。（二）幾種常用薄層色譜分離

6、模式的展開機制1.液固吸附展開在TLC分離中，液固展開是一種最經(jīng)典的展開方式。液固展開常用極性吸附硅膠、氧化鋁作固定相。流動相依其極性可在吸附劑表面形成單分子或雙分子溶劑吸附層，展開過程中，組分的保留及分離選擇性主要有以下三種因素決定：a. 溶劑對樣品的溶解能力；b. 溶質(zhì)和流動相分子對固定相表面活性吸附位點的競爭；c. 溶質(zhì)分子與吸附劑表面上吸附中心間的特殊作用力。2.液液分配展開與液液分配柱色譜分配機理相同，組分在互不相溶的兩液相中的溶解度不同，因此遷移速率存在差異，在遷移過程中得到分離。除以上兩種展開機制外，還有化學(xué)鍵合相展開和離子交換展開。四 薄層色譜吸附劑與載體的選擇1.薄層色譜對吸

7、附劑的要求為：1.具有大的表面積與足夠的吸附能力；2.對不同的組分有不同的吸附性，因而能較好的分離不同的化學(xué)組分；3.在所用的溶劑和展開劑中不溶解；4.不與試樣中各組分、溶劑和展開劑起化學(xué)反應(yīng)或破壞、分解作用5.顆粒均勻、在使用過程中不會碎裂6.具有可逆的吸附性，既能吸附樣品組分，又易于解吸；7.為便于觀察分離結(jié)果，最好是白色固體。2.分配色譜對所用載體的要求為：a.表面積大；b.在展開劑中不溶解，與展開劑和樣品組成不起化學(xué)反應(yīng)或分解作用；c.對樣品組分無吸附性或吸附性極弱；d.對固體液是惰性的。五 薄層色譜掃描儀（一）儀器結(jié)構(gòu) TLC掃描儀結(jié)構(gòu)主要包括光學(xué)元件組合系統(tǒng)、電子元件組合系統(tǒng)及機械

8、元件組合系統(tǒng)。（二）主要功能薄層色譜掃描儀主要用于TLC圖被分離斑點和薄層空白的光學(xué)相應(yīng)信號測量。要求儀器光源穩(wěn)定，光波單色性能好，光波長在（200800nm）檢測器靈敏度高。六 薄層色譜定性定量方法（一）斑點定位斑點定位必須采用非破壞性方法。當(dāng)斑點紫外光顯示時，可采用長波長和短波長紫外燈，使用方便、靈活。采用化學(xué)試劑顯色時，通過手動或電動噴霧器向展開好的薄層板噴灑顯色試劑。（二）定性方法1.利用保留值定性在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物的Rf值一定，比較未知物和標(biāo)準(zhǔn)物的Rf值，能夠作為鑒定未知物的依據(jù)。Rf值的準(zhǔn)確測定受多方面因素影響，為了增加Rf值定性的可靠性，必須通過改變色譜系統(tǒng)的選擇性，重復(fù)

9、測定同一化合物的Rf值。如果在分離機理不同的色譜體系中，比較Rf值仍能得到肯定的結(jié)果，那么其可靠性將更大。2.板上化學(xué)反應(yīng)定性板上化學(xué)反應(yīng)定性主要有以下兩種方式：a. 反應(yīng)后生成特征顏色的化合物，借以鑒定反應(yīng)物；b. 反應(yīng)后生成復(fù)雜的、無法鑒定組分的混和物，但可根據(jù)生成物的“指紋”特征加以鑒定；c. 除以上兩種定性反方法外，還有板上光譜定性、TLC與其他聯(lián)用技術(shù)間接聯(lián)用定性、薄層色譜傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用定性以及薄層色譜質(zhì)譜聯(lián)用定性。（三） 定量方法1.間接定量法間接定量法就是將TLC已分離的物質(zhì)斑點洗脫下來，再采用其他方法對該洗脫液進(jìn)行定量分析。TLC間接定量的關(guān)鍵是斑點組分的定量洗脫。選用

10、怎樣的洗脫方法，取決于，組分和薄層吸附劑的性質(zhì)。用來洗脫組分斑點的溶劑，對下一步定量方法應(yīng)無影響。a. 分光光度法 將下來的洗脫液配制成標(biāo)準(zhǔn)體積，再同樣條件下對樣品和標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行吸光值測量。b. HPLC法 以TLC法斑點洗脫液直接作HPLC分離和定量c. GC法 以TLC法斑點洗脫液直接作GC分離和定量。d. 質(zhì)譜法 采用組分質(zhì)譜圖中的特征離子峰可進(jìn)行定量。2.直接定量法a. 斑點面積測量法 以半透明紙掃下TLC圖上的斑點界限，然后測量其面積。將斑點面積同平行操作的標(biāo)準(zhǔn)樣面積相比較進(jìn)行定量。b. 目測法 將被測樣品和系列溶液點在同一薄層板上，展開后用適當(dāng)方法顯色，可以得到系列斑點，將被測樣品的

11、斑點面積大小和顏色與標(biāo)準(zhǔn)系列的斑點相比較，可推測出樣品的含量范圍。這種定量法非常適用于對常規(guī)大量樣品的重復(fù)分析。七 應(yīng)用實例TLC測定黃曲霉毒素B1 （一）、原理根據(jù)黃曲霉毒素B1能在波長365毫微米紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光的特性，采取薄層層析法，將樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，利用其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定其含量。（二）、試劑1.石油醚：沸程 30602.正已烷3.氯仿4.苯5.乙腈6.甲醇7.無水乙醚：如不是無水乙醚，則應(yīng)脫水后再用。8.丙酮9.無水硫酸鈉10.硅膠G：薄層層析用11.苯乙腈混合液：取苯98毫升，乙腈2毫升，混勻冰箱存放備用。12.三氟醋酸13.黃曲霉毒素消毒劑：5

12、次氯酸鈉溶液，取100克漂粉精，加入500毫升水，攪勻，另溶解70克碳酸鈉（Na2Co3、H2O）于500毫升溫水中，溶后，倒入上述溶液中攪勻、澄清、過濾、備用。14.黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.02微克/毫升）：GBW(E)090015嚴(yán)格控制、應(yīng)加鎖于冰箱中避光存放。（每次記錄用量、余量，以備復(fù)查）。稀釋液（0.2微克/毫升）取儲備液加苯乙腈混合液稀釋。稀釋液（0.04微克/毫升）取稀釋液1毫升以苯乙腈混合液稀釋。（三）、儀器1.小型粉碎機2.分樣篩一套3.電動振蕩器4.電吹風(fēng)機5.薄層板涂布器（可以自制）6.玻璃板：5×20厘米7.展開槽：（層析）內(nèi)長25厘米，寬6厘米，

13、高4厘米8.110毫升刻度吸管9.紫外光燈：365nm，220v，125w，啟動電流1.8A10.微量進(jìn)樣器：20微升，10微升11.分液漏斗：125毫升12.蒸發(fā)器：60毫升13.玻璃漏斗14.樣液瓶：具塞2毫升15.脫脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取2小時揮干備用16.電熱恒溫水?。ㄋ模?、操作方法1.提取適用于大米、玉米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等。稱取經(jīng)過粉碎（20目篩）的樣品20克于250毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷30毫升，甲醇水（5545）100毫升，加塞后加水少許，蓋嚴(yán)防漏，振蕩30分鐘，靜置片刻，以脫脂棉過濾于分液漏斗中，待分層，放出下層的甲醇水溶液20毫升（相當(dāng)于

14、樣品4克）于另一分漏斗中，加氯仿20毫升，振搖二分鐘，靜止分層。另備一漏斗底部鋪脫脂棉少許，再加無水硫酸鈉10克，下接60毫升蒸發(fā)皿，漏斗中的無水硫酸鈉先用氯仿濕潤。將分層后的氯仿放入已備好的具有無水硫酸鈉的漏斗中，過濾，再加5毫升氯仿于分液漏斗中，分層后一并濾于同一蒸發(fā)皿中，最后用少量氯仿洗滌濾器，洗液并入以上蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥內(nèi)于65水浴上通風(fēng)揮干，然后放在水浴上冷卻23分鐘，準(zhǔn)確加入苯乙腈1毫升。用帶橡皮頭的滴管的尖端將殘渣充分混合，若有結(jié)晶析出（苯），將蒸發(fā)皿從水浴上取下，繼續(xù)溶解，混合，晶體消失，再用此管吸取上清液，轉(zhuǎn)移于2毫升樣液瓶中，若溶液不夠澄清，應(yīng)離心，或放置等候澄

15、清，取上清液供薄層點板用。注加入氯仿振搖2分鐘如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層或用電吹風(fēng)機吹熱風(fēng)促使分層。含油脂較多的樣品如花生等也可采用脫油提取，即稱取粉碎樣品20克移于濾紙筒內(nèi)，筒內(nèi)塞以少量脫脂棉，置于250毫升脂肪提取器內(nèi)，在7585水浴上以石油醚提取脫油8小時，然后將濾紙筒揮干。將脫油后的樣品移于250毫升具塞三角燒瓶內(nèi)，進(jìn)行檢驗。如樣品是玉米、大米、小麥時亦可采用下法提?。悍Q取粉碎過篩樣品20克于250毫升具塞三角燒瓶內(nèi)，用滴管滴加6毫升水，使樣品濕潤，并準(zhǔn)確加入氯仿60毫升，振蕩30分，加無水硫酸鈉12克，振搖靜止30分；以脫脂棉過濾取濾液12毫升（相當(dāng)于樣品4克）于蒸發(fā)皿，以下

16、步驟與同。適用于花生油、香油、芽籽油等。稱取樣品4克于小燒杯中，用正已烷20毫升轉(zhuǎn)移于125毫升分液漏斗中，再用甲醇水（55+45）20毫升分?jǐn)?shù)次洗滌小燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖2分鐘，靜止分層后，將下層甲醇水溶液移于第二個分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水5毫升，振蕩提取一次，甲醇水溶液一并移入第二個分液漏斗中，在第二個分液漏斗中加入氯仿20毫升，振搖二分靜止分層以后按操作。適用于醬油、醋，方法有二：第一法：稱取樣品10克于小燒杯中，為防止提取時乳化，加氯化鈉4克，移于分液漏斗中，燒杯用氯仿15毫升分次洗滌，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振搖2分鐘，靜止分層后按第操作。最后加入2.5

17、毫升苯乙腈溶解，此液每毫升相當(dāng)于樣品4克。第二法：稱取樣品10克移于分液漏斗中，加甲醇12毫升（以醬油代替水，故甲醇與水體積比仍約為55+45）加氯仿20毫升提取，以下自振搖2分鐘起，按操作，最后加苯乙腈2.5毫升，每毫升相當(dāng)于樣品4克。適用于醬類（包括豆乳制品）稱取樣品20克于250毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷20毫升與甲醇水50毫升，振蕩30分鐘，靜止片刻，以脫脂棉過濾，濾液靜止分層后，取甲醇水24毫升于分液漏斗中加入氯仿20毫升振蕩2分靜止分層下以按操作，最后加入苯乙腈2毫升，每毫升相當(dāng)于樣品4克。注：以上檢品極易乳化，實在分不開層時，可采用離心分層的辦法。適用于發(fā)酵酒類稱取樣品10克于

18、小燒杯中，以氯仿15毫升分次洗于分液漏斗中，振搖2分鐘，靜置分層后按操作，最后加入苯乙腈2.5毫升，此溶液每毫升相當(dāng)于樣品4克。適用發(fā)酵用曲種及菌株稱取樣品10克于具塞三角燒瓶中，加入正已烷30毫升與甲醇水（55+45）80毫升，振蕩半小時，用脫脂棉過濾于分液漏斗中，取出甲醇水溶液32毫升（相當(dāng)于樣品4克）于另一分液漏斗中，加入30毫升氯仿提取。振搖2分靜止分層。以下按操作。2.薄層色譜分析和計算（1）單向展開法a.薄層板的制備：一般現(xiàn)在用成品硅膠板。如需自己制板，方法如下：稱取硅膠G約3克（或稱取硅膠85克與石膏粉15克，充分混合均勻后稱取3克）加相當(dāng)于硅膠23倍的水在玻璃乳缽中研磨12分鐘

19、，至成均勻的糊狀后立即倒入涂布器內(nèi)，推成5×12厘米，厚約0.25毫米的薄層板3塊。在空氣中干燥15分鐘后，放入烘箱內(nèi)100活化2小時取出放入干燥器內(nèi)保存，一般在干燥器內(nèi)可保存23天，若放置時間較長，則應(yīng)重新活化。b.點樣將薄層板邊緣上附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3厘米的基線上，用進(jìn)樣器滴加樣液，一塊可以滴加四個點，點距邊緣和點間距離約為1厘米，點直徑應(yīng)掌握在3毫米以內(nèi)為好，在同一板上滴加的點應(yīng)大小一致，在滴加樣液的時候，可以吹風(fēng)機吹冷風(fēng)邊吹邊點。滴加試樣如下：第一點：黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液（0.04微克/毫升）10微升。第二點：樣液20微升（如樣液8克/毫升）時也可點10微升。第三點

20、：樣液20微升加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（0.04微克/毫升）10微升。第四點：樣液20微升加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（0.2微克/毫升）10微升。C.展開與觀察在展開槽（層析槽）內(nèi)加無水乙醚10毫升，予展12厘米，取出揮干，再于另一展開槽內(nèi)加丙酮氯仿液（8+92）展開1012厘米取出在紫外光（365毫微米）下觀察，結(jié)果如下：樣液點上加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，可使黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點與樣液中的黃曲霉毒素B1螢光點重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點黃曲霉毒素B1為0.0004微克，可用作檢查在樣液內(nèi)黃曲霉毒素B1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽性，則起定位作用，薄層板上的第四點中黃曲霉毒素B1為0.00

21、2微克，主要起定位作用，若第二點在與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)位置上，無藍(lán)色熒光點，表示樣品中黃曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點，則需要確證試驗。D.確證試驗為了證實薄層板上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，滴加三氟乙酸產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的衍生物，展開后，這種衍生物的比移值，約在0.1左右。其方法是：在薄層板左邊依次滴加兩個點：第一點：樣液20微升。第二點：黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2微克/毫升）10微升，以上兩點各加三氟醋酸一小滴蓋于樣點上，反應(yīng)五分鐘后，用吹風(fēng)機吹熱風(fēng)2分鐘，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40，再于薄層板上滴加2個點。第三點：樣液20微升。

22、第四點：黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2微克/毫升）10微升。再展開同前，在紫外燈光下，觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1相同的衍生物，未加三氟乙酸與3、4兩點，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。E.稀釋定量樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點的熒光強度如與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點的最低檢出量（0.0004微克）的熒光強度一致，則樣品中的黃曲霉毒素定量即為5微克/公斤，如樣品中的熒光強度比最低檢量強，則根據(jù)強度估計減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯?，再滴加不同的微升?shù)，如10微升、15微升，直至樣液點的熒光強度與最低檢出量點的熒光強度一致為止。滴加試樣如下：第一點：黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液（0.04微克/毫升）第二點第

23、三點 根據(jù)情況滴加樣液第四點（五）、結(jié)果計算黃曲霉毒素B1（微克/公斤）式中：V1加入苯乙腈混合液的毫升數(shù)，毫升；V2出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的毫升數(shù)，毫升；D1樣液的總稀釋倍數(shù)；W1苯乙腈溶解時相當(dāng)試樣重量克數(shù)，克；0.0004黃曲霉毒素B1的最低檢出量，微克。如用單向展開法展開后，薄層板上由于雜質(zhì)的干擾，掩蓋了黃曲霉毒素B1的熒光強度時，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙醚作橫向展開，把干擾的雜質(zhì)推到樣液點的旁邊，而黃曲霉毒素B1不動，然后再用丙酮氯仿混合液進(jìn)行縱展，這樣試樣里在黃曲霉毒素B1相應(yīng)處的雜質(zhì)的顏色將大量減少，因而就提高了方法的靈敏度，如用雙向展開法中的滴加兩點法展開后仍有雜質(zhì)時

24、則可改用滴加一點法，現(xiàn)將兩種方法分別介紹于后面。A.滴加兩點法首先是滴樣，取薄層板三塊，在距下端三厘米基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣液，其具體作法是：在三塊板距左邊緣0.8厘米處各滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.04微克/毫升）10微升，在距左邊緣2.8厘米各滴加樣液20微升；然后在第二塊板的樣液點上加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.04微克/毫升）10微升。在第三塊板的樣液點上加滴黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2微克/毫升）10微升。第二步展開。先進(jìn)行橫展，在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加無水乙醚10毫升，將點好的板靠標(biāo)準(zhǔn)點的長邊置于層析槽內(nèi)展開，展至板端后繼續(xù)展開1分鐘，取出揮干再進(jìn)行縱展

25、。揮干的薄層板以丙酮氯仿（8+92）展開至12厘米為止（丙酮、氯仿比例也可根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)）。然后進(jìn)行觀察和評定結(jié)果。在紫外燈光下，觀察第一、二板，若第二板的第二點在B1標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點，則試樣中黃曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下。若第一板與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點與第一板上第二點的相同位置的熒光點是與B1的標(biāo)準(zhǔn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行以下衍生物確證試驗。在具體測定中第一、二、三板可以同時作，亦可按照順序作，當(dāng)?shù)谝话宄霈F(xiàn)陰性時第三板可以省略。如第一板為陽性，第二板可省略，直接作第三板。如果需

26、要作確證試驗，于第四、五兩板距邊緣0.8厘米處各滴加B1標(biāo)準(zhǔn)液（0.2微克/毫升）10微升，再于其上滴加三氟醋酸一小滴，距左邊緣2.8厘米處，第四板滴加樣液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加樣液20微升，黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2微克/毫升）10微升，三氟乙醋一小滴，產(chǎn)生衍生物的步驟同單相展開法。再用雙向展開法，展開后，觀察樣液點是否產(chǎn)生與B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊的產(chǎn)物，觀察時可將第一板作為樣液的衍生物后的板。如樣液黃曲霉毒素B1含量高時，則將樣液稀釋后，按單向展開法D項作確證試驗。并按照單向展開法進(jìn)行稀釋定量，如含毒素低稀釋倍數(shù)小，在定量的縱板上仍有干擾，并影響結(jié)果判斷，可將板上需要判斷的樣液點再分

27、別作雙向展開觀察，以確定含量，結(jié)果計算，同單向展開法。B.滴加一點法（多用于雜質(zhì)干擾嚴(yán)重的樣液）滴樣：取薄層板三塊，在距下緣3厘米的基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液與樣液。作法是在三塊板的左邊緣0.8厘米處各滴加樣液20微升。第二板的點上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（0.04微克/毫升）10微升，在第三板的點上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2微克/毫升）10微升。展開：同滴加兩點中的橫展和縱向展開。觀察與評定結(jié)果：在紫外光燈下，觀察一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的B1標(biāo)準(zhǔn)點，而第一板與其相同位置未出現(xiàn)熒光點，樣品中黃曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如第一板在與第二板B1標(biāo)點相同位置出現(xiàn)熒光點

28、，則應(yīng)將第一板與第二板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點，是否與B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗。滴加以下二板，距左邊緣0.8厘米處第四板滴加樣液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加樣液20微升，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（0.2微克/毫升）10微升及三氟醋酸一小滴，產(chǎn)生衍生物的步驟同單向展開法，再用雙向展開法展開后，將以上兩板在此外光燈下觀察，以確定樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點重疊的衍生物，觀察時可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過以上確證試驗定為陽性后，再進(jìn)行稀釋定量。如含黃曲霉毒素B1低不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B1熒光的強弱，直接用雙

29、向展開法定量?；蛘吲c單向展開法結(jié)合使用，方法同上。其計算同單向展開法。注意事項：（1）黃曲霉菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有較強毒性，自然界中易被污染的有玉米、花生等，其中以黃曲霉毒素B1最多，B2、G1、G2較少。故我們一般僅作黃曲霉毒素B1測定。在測定中黃曲霉毒素高的霉粒，一粒就可以左右測定結(jié)果，而有毒霉粒在整個檢品中占比例是小的，而分布又不均勻，為避免采樣帶來的誤差，取樣量應(yīng)盡量多一些，（1000克）并將取樣充分均合盡多的粉碎，使盡量取得相對可靠一些的結(jié)果，因而在取樣時應(yīng)注意：根據(jù)規(guī)定檢取有代表性樣品。對局部霉變樣，應(yīng)單獨取樣檢驗。每份分析測定用樣品，應(yīng)將大樣經(jīng)粗碎后連續(xù)多次用四分法分樣至12斤

30、再全部粉碎糧食樣品，通過20目篩，花生不易過篩。但應(yīng)磨到一定程度并充分混合均勻。（2）據(jù)以上實驗條件黃曲霉毒素B1的最低檢出量是0.0004微克，方法的靈敏度為5微克/公斤，回收率約為75以上。（3）展開劑丙酮與氯仿比例可隨比移值大小，與分離情況而調(diào)節(jié)，如果比移值太大，可減少丙酮體積反之則增加。（4）對雜質(zhì)少含毒量又高的樣品可不予展，直接用丙氯液（8+92）展開。（5）在氣候潮濕的條件下，薄層板的活性容易降低，影響檢出量，因此在使用薄層板時，當(dāng)日活化為好，滴加樣液和標(biāo)準(zhǔn)液時，可將板放在盛有干燥劑（硅膠）的層析槽內(nèi)進(jìn)行。（6）玉米、大米、小麥、面粉、花生等試樣按方法提取后，用上述單向展開法測定，

31、薯干用雙向展開法測定。（7）在具體測定條件下，有時用無水乙醚作薄層板的橫展后，標(biāo)準(zhǔn)B1點仍有稍微移動，這并不影響測定結(jié)果。（8）在80200目硅膠中加熱鹽酸水溶液（1+4）浸沒硅膠，攪拌15分鐘后，傾去上液，再用水洗至無氯離子為止，于100干燥，磨碎，過250目篩，此種硅膠的性能較為滿意。于空白樣液點上滴加黃曲霉毒素B1最低檢出量時，經(jīng)展開后，能使黃曲霉毒素B1點與雜質(zhì)分離，沒有拖尾現(xiàn)象，而且在暗的條件下，其點形十幾小時內(nèi)不消失。 第二章氣相色譜法一 氣相色譜法概述色譜或?qū)游鍪且环N分離技術(shù)，色譜法是利用色譜技術(shù)進(jìn)行分離分析的方法。最早色譜法是由俄國植物學(xué)家茨維特于1906年首先提出來的。他把植

32、物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣吸附劑的直立玻璃管內(nèi)，再加入石油醚使其自由流出，結(jié)果不同色素組分相互分離而形成不同顏色的譜帶，由此得名為“色譜“。該法后來雖廣泛用于無色物質(zhì)的分離，但“色譜“一詞卻被沿襲使用.流動相為氣體的色譜方法稱為氣相色譜法。二 氣相色譜法的基本原理和氣相色譜術(shù)語1色譜過程氣相色譜對多組分的分離依賴于核心裝置色譜柱。色譜柱主要分為兩種類型，填充柱與毛細(xì)管柱，其內(nèi)均填充具有一定特性的固定相物質(zhì)。色譜分離過程實際上是不同組分與固定相和流動想（載氣）發(fā)生相互作用的結(jié)果?，F(xiàn)以填充柱中的兩類固定相為例說明氣-固色譜分離的原理。其固定相是一種具有較大面積的多孔性的顆粒吸附劑。試樣被載

33、氣帶進(jìn)柱子里。立即被這種顆粒吸附劑所吸附。載氣不斷流過顆粒時，被吸附的組分又被洗脫下來。洗脫的組分隨著載氣繼續(xù)前進(jìn)時，又可被前面的吸附顆粒所吸附。隨著載氣的流動，被測組分在吸附劑表面進(jìn)行反復(fù)的吸附洗脫。由于被測物質(zhì)中各個組分的性質(zhì)不同，他們在吸附劑上的吸附能力就不一樣，較難被吸附的組分就容易被洗脫，較快地移向前面。容易被吸附的組分就不易被洗脫，向前移動地慢些。經(jīng)過一定時間，試樣中的各個組分就彼此分離而先后流出色譜柱。2氣相色譜術(shù)語試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，經(jīng)檢測、記錄儀得到反映組分濃度信號與流出時間關(guān)系流出曲線色譜圖。色譜法的測定結(jié)果是通過對色譜圖的分析完成的。1關(guān)于基線a基線當(dāng)色譜過程沒有

34、組分進(jìn)入檢測器，在實驗操作條件下，反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化的記錄線稱為基線。穩(wěn)定的基線是一條直線。b基線漂移指基線隨時間定向的緩慢變化。c基線噪聲指由各種因素所引起的基線起伏。2保留值表示各組分在色譜柱中的滯留時間的數(shù)值。通常用時間來表示。a死時間（tM）指不被固定相吸附或溶解的氣體，從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值時所需要的時間。b保留時間（tR）指被測組分從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)濃度最大值時所需要的時間。c調(diào)整保留時間（tR）指扣除死時間后的保留時間。tR=tR-tMd相對保留時間（r12）指某組分1的調(diào)整保留時間與另一組分2的調(diào)整保留時間之比。r12= tR2/tR13色譜峰區(qū)域?qū)挾壬V流

35、出曲線中一個重要參數(shù).從色譜分離角度看,希望區(qū)域?qū)挾仍秸胶?通常度量色譜峰區(qū)域?qū)挾扔袃煞N方法：a半峰寬度(Wh/2)又稱半寬度或區(qū)域?qū)挾?即峰高一半處的寬度。b峰底寬度(W)自色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點所作的切線在基線上的截距。三 氣相色譜儀器結(jié)構(gòu)氣相色譜法是采用惰性氣體（或稱載氣）作為流動相的色譜方法。色譜過程是通過氣相色譜儀來完成的。氣相色譜儀一般有5個基本部分組成：1 氣路系統(tǒng) 包括載氣、燃燒氣、助燃?xì)?、氣體凈化器流速控制和測量器2 進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣器、氣化室；溫度控制裝置3 分離系統(tǒng) 色譜柱和柱箱、柱溫控制裝置4 檢測系統(tǒng) 檢測器、檢測器的電源及控溫裝置5 記錄系統(tǒng) 放大器、記錄儀以及數(shù)據(jù)處理

36、裝置四 氣相色譜法的特點和適用范圍（一）氣相色譜法的特點氣相色譜法具有人們公認(rèn)的優(yōu)點、特點：1分離效率高，分析速度快2選擇性能好3樣品用量少和檢測靈敏度高4操作簡單，費用低少，應(yīng)用廣泛（二）氣相色譜法的適用范圍氣相色譜分析操作簡單，分析快速，選擇性好，柱效能高，可以應(yīng)用于分析氣體試樣，也可以分析易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的液體和固體，不僅可分析有機物，也可分析部分無機物。一般，只要沸點在500oC以下，熱穩(wěn)定性良好，相對分子質(zhì)量在400以下的物質(zhì)，原則上都可采用氣相色譜法。目前氣相色譜法所能分析的有機物，約占全部有機物的15%20%，而這些有機物都是目前應(yīng)用很廣的那一部分，因而氣相色譜法的應(yīng)用是十

37、分廣泛的。五 氣相色譜條件的選擇（一）一般選擇載氣的依據(jù)及氣相色譜常用的載氣作為氣相色譜載氣的氣體，要求要化學(xué)穩(wěn)定性好；純度高；價格便宜并易取得；能適合于所用的檢測器。常用的載氣有氫氣、氮氣、氬氣、氦氣、二氧化碳?xì)獾鹊?。（二）載氣的凈化所謂凈化，就是除去載氣中的一些有機物、微量氧，水分等雜質(zhì)，以提高載氣的純度。不純凈的氣體作載氣，可導(dǎo)致柱失效，樣品變化，氫焰色譜可導(dǎo)致基流噪音增大，熱導(dǎo)色譜可導(dǎo)致鑒定器線性變劣等，所以載氣必須經(jīng)過凈化。一般均采用化學(xué)處理的方法除氧，如用活性銅除氧；采用分子篩、活性碳等吸附劑除有機雜質(zhì)；采用矽膠，分子篩等吸附劑除水分。（三）試樣的進(jìn)樣方法色譜分離要求在最短的時間內(nèi)

38、，以“塞子”形式打進(jìn)一定量的試樣，進(jìn)樣方法可分為：、氣體試樣：大致進(jìn)樣方法有四種：（）注射器進(jìn)樣，（）量管進(jìn)樣，（）定體積進(jìn)樣，（）氣體自動進(jìn)樣。一般常用注射器進(jìn)樣及氣體自動進(jìn)樣。注射器進(jìn)樣的優(yōu)點是使用靈活，方法簡便，但進(jìn)樣量重復(fù)性較差。氣體自動進(jìn)樣是用定量閥進(jìn)樣，重復(fù)性好，且可自動操作。、液體試樣：一般用微量注射器進(jìn)樣，方法簡便，進(jìn)樣迅速。也可采用定量自動進(jìn)樣，此法進(jìn)行重復(fù)性良好。、固體試樣：通常用溶劑將試樣溶解，然后采用和液體進(jìn)樣同樣方法進(jìn)樣。也有用固體進(jìn)樣器進(jìn)樣的。（四）在氣相色譜分析中柱長、柱內(nèi)徑、柱溫、載氣流速、固定相、進(jìn)樣等操作條件對分離的影響操作條件對于色譜分離有很大影響。、柱長

39、，柱內(nèi)徑：一般講，柱管增長，可改善分離能力，短則組分餾出的快些；柱內(nèi)徑小分離效果好，柱內(nèi)徑大處理量大，但柱內(nèi)徑過大，將導(dǎo)致?lián)w不能均勻地分布在色譜柱中。分析用柱管一般內(nèi)徑為毫米，柱長為米。 、柱溫：是一個重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫的根據(jù)是混合物的沸點范圍，固定液的配比和鑒定器的靈敏度。提高柱溫可縮短分析時間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，柱壽命延長。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點的柱溫為較合適，對易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫。 、載氣流速：載氣流速是決定色譜分離的重要原因之一。一般講流速高色譜峰狹，反之則寬些

40、，但流速過高或過低對分離都有不利的影響。流速要求要平穩(wěn)，常用的流速范圍每分鐘在亳升之間。 、固定相：固定相是由固體吸附劑或涂有固定液的擔(dān)體構(gòu)成。 （）固體吸附劑或擔(dān)體粗細(xì)：一般采用目、目、目。當(dāng)用同等長度的柱子，顆粒細(xì)的分離效率就要比粗的好些。 （）固定液含量：固定液含量對分離效率的影響很大，它與擔(dān)體的重量比一般用。比例過大有損于分離，比例過小會使色譜峰拖尾。 、進(jìn)樣：一般講進(jìn)樣快，進(jìn)樣量小，進(jìn)樣溫度高其分離效果好。對進(jìn)液體樣，速度要快，汽化溫度要高于樣品中高沸點組分的沸點值，一次汽化，保證色譜峰形不致展寬、使柱效高。當(dāng)進(jìn)樣量在一定限度時，色譜峰的半峰寬是不變的。若進(jìn)樣量過多就會造成色譜柱超載

41、。一般講柱長增加四倍，樣品的許可量增加一倍。對于常規(guī)分析，液體進(jìn)樣量為微升；氣體進(jìn)樣量為.毫升。（五）色譜柱管材料選擇原則及常用的柱管材質(zhì) 對色譜柱管材質(zhì)，應(yīng)按如下要求選擇： 、應(yīng)與固定相、試樣、載氣不起化學(xué)反應(yīng)。 、要易于加工成型。 、管內(nèi)壁應(yīng)光滑，橫截面應(yīng)均勻呈圓形。一般色譜柱管形狀呈型或螺旋形，大多由銅、不銹鋼，玻璃等材質(zhì)制成。（六）新的色譜柱管（銅或不銹鋼管）應(yīng)處理后方能使用新柱管應(yīng)先用稀酸或稀堿（：鹽酸或氫氧化鈉）洗滌，以除去油污等臟垢，而后用自來水沖洗,繼而用蒸餾水沖洗至中性，再用干凈的空氣吹洗并烘干后，即可使用了。（七）對擔(dān)體的要求 擔(dān)體是一種多孔性化學(xué)惰性固體，在氣相色譜中用來

42、支撐固定液。對擔(dān)體有如下幾點要求： 、表面積較大，一般應(yīng)在.米2 克之間； 、具有化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性； 、有一定的機械強度，使涂漬和填充過程不引起粉碎； 、有適當(dāng)?shù)目紫督Y(jié)構(gòu)，利于兩相間快速傳質(zhì)； 、能制成均勻的球狀顆粒，利于氣相滲透和填充均勻性好； 、有很好的浸潤性，便于固定液的均勻分布。完全滿足上述要求的擔(dān)體是困難的，人們在實踐中只能找出性能比較優(yōu)良的擔(dān)體。（八）擔(dān)體分類及其特點 通常分為硅藻土和非硅藻土兩大類，每一類又有種種小類。 、硅藻土類型： （）白色的：表面積小，疏松，質(zhì)脆，吸附性能小，經(jīng)適當(dāng)處理，可分析強極性組分； （）紅色的：有較大的表面積和較好的機械強度，但吸附性較大。 2、非

43、硅藻土類型： （）氟擔(dān)體：表面惰性好，可用來分析高極性和腐蝕性物質(zhì)，但裝柱不易，柱效率低些。 （）玻璃微球：表面積小，用它做擔(dān)體柱溫可以大大降低，而分離完全且快速。但涂漬困難，柱效低。 （）多孔性高聚物小球：機械強度高，熱穩(wěn)定性好，吸附性低，耐腐蝕，分離效率高，是一種性能優(yōu)良的新型色譜固定相。 （）炭分子篩：中性，表面積大，強度高，祛壽命長，在微量分析上有無比的優(yōu)越性。 （）活性炭：可以單獨做為固定相。 （）沙：主要用于分離金屬。（九）常用的擔(dān)體擔(dān)體：為白色硅藻土擔(dān)體；擔(dān)體：為白色硅藻土擔(dān)體；celite545：為白色硅藻土擔(dān)體；擔(dān)體：為紅色硅藻土擔(dān)體； 擔(dān)體：為紅色硅藻土擔(dān)體；保溫磚：為紅色

44、硅藻土擔(dān)體；chromosorb：為紅色硅藻土擔(dān)體。（十）擔(dān)體進(jìn)行處理的一般方法常用的擔(dān)體表面并非惰性，它具有不同程度的催化作用和吸附性（特別是固定液含量低時和分離極性物質(zhì)時）造成峰拖尾和柱效下降，保留值改變等影響，因而需要預(yù)處理。現(xiàn)將一般處理方法簡述如下： 、酸洗法：用濃鹽酸加熱處理擔(dān)體分鐘，然后用自來水沖洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干備用。此法主要除去擔(dān)體表面的鐵等無機物雜質(zhì)。 、堿洗法：用的氫氧化鈉或的氫氧化鉀甲醇溶液浸泡或回流擔(dān)體，然后用水沖洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干備用。堿洗的目的是除去表面的三氧化二鋁等酸性作用點，但往往在表面上殘留微量的游離堿，它能分解或吸附一些非堿性物質(zhì)，使用時

45、要注意。 、硅烷化：用硅烷化試劑和擔(dān)體表面的硅醇、硅醚基團(tuán)起反應(yīng)，除去表面的氫鍵結(jié)合能力，可以改進(jìn)擔(dān)體的性能。常用的硅烷化試劑有二甲基二氯硅烷和六甲基二硅胺。 、釉化：把欲處理的擔(dān)體在、的碳酸鈉碳酸鉀（：）水溶液中浸泡一天，烘干后先在度下煅燒、小時，然后升溫到度煅燒約分鐘。經(jīng)過這樣處理，擔(dān)體表面形成一層玻璃化的釉質(zhì)，故稱“釉化擔(dān)體”。這種擔(dān)體的吸附性能小，強度大，當(dāng)固定液中加入少量的去尾劑后，能分析如醇、酸等極性較強的物質(zhì)。但對非極性物質(zhì)柱效能則稍有下降。此外甲醇和甲酸等物質(zhì)在釉化擔(dān)體上有一定的不可逆化學(xué)吸附，在定量分析時應(yīng)予以注意。、其他純化方法：凡是用化學(xué)反應(yīng)來除去活性作用點或用物理復(fù)蓋以

46、達(dá)到純化擔(dān)體表面性質(zhì)的方法都可以使用。（十一）常用的擔(dān)體目數(shù)常用的毫米內(nèi)徑的色譜柱：對于較長色譜柱，選用擔(dān)體目數(shù)一般為目；對于較短色譜柱選用擔(dān)體目數(shù)一般為目(每英寸內(nèi)的篩孔數(shù)目為目)。（十二）常用擔(dān)體的選擇 各種擔(dān)體，名目繁多。在常用硅藻土擔(dān)體中: 紅色擔(dān)體（如、），可用于非極性或弱極性物質(zhì)的分離。 白色擔(dān)體（如）可用于極性物質(zhì)或堿性物質(zhì)。 釉化紅色擔(dān)體（如）可用于中等極性物質(zhì)。 硅烷化白色擔(dān)體可用于強極性氫鍵型物質(zhì)如廢水測定。 分離酸性物質(zhì)，如酚類，要用酸洗處理的擔(dān)體。 分離堿性物質(zhì)，如乙醇胺，要用堿洗處理的擔(dān)體。 微量分析要用硅烷化的擔(dān)體。 有些特殊的情況下要用特殊的擔(dān)體，如氟擔(dān)體分離異氰

47、酸酯類。但是在普通的常量分析中，對擔(dān)體可以不必過份講究，甚至如耐火磚粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。（十三）固體固定相分類 指直接裝填到色譜柱中作為固定相的具有活性的多孔性固體物質(zhì)。固體固定相大體可分為三類： 第一類是吸附劑。如：分子篩、硅膠、活性炭、氧化鋁等； 第二類是高分子聚合物。如國內(nèi)的型高分子多孔微球，國外orapak系列等； 第三類是化學(xué)鍵合固定相。在氣相色譜中，通常是將固定液涂敷在載體表面上。采用化學(xué)鍵合固定相分析極性或非極性物質(zhì)通常都能夠得到對稱峰，柱效很高，固定相的熱穩(wěn)定性也有所改善。 （十四）對固定液有要求 一般是一種高沸點的有機物的液膜，通過對不同組份的不同分子間的作用，使

48、組份在色譜柱中得到分離。對氣相色譜用的固定液，一般有如下幾點要求： 、在操作溫度下蒸氣壓低，熱穩(wěn)定性好，與被分析物理或載氣不產(chǎn)生不可逆反應(yīng)； 、在操作溫度下呈液態(tài)，而且粘度愈低愈好。物質(zhì)在高粘度的固定液中傳質(zhì)速度慢，柱效率因而降低。這決定固定液的最低使用溫度； 、能牢固地附著在載體上，并形成均勻和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的薄層； 、被分離的物質(zhì)必須在其中有一定的溶解度，不然就會很快地被載氣帶走而不能在兩相之間進(jìn)行分配； 、對沸點相近而類型不同的物質(zhì)有分離能力，即保留一種類型化合物的能力大于另一種類型。這種分離能力即是固定液的選擇性。（十五）固定液的選擇原則 根據(jù)被分離組分和固定液分子間的相互作用關(guān)系，固定液的

49、選擇一般根據(jù)所謂的“相似性原則”，即固定液的性質(zhì)與被分離組分之間的某些相似性，如官能團(tuán)、化學(xué)鍵、極性、某些化學(xué)性質(zhì)等，性質(zhì)相似時，兩種分子間的作用力就強，被分離組分在固定液中的溶解度就大，分配系數(shù)大，因而保留時間就長；反之溶解度小，分配系數(shù)小，因而能很快流出色譜柱。 下面就不同情況進(jìn)行討論： a、分離極性化合物，采用極性固定液。這時樣品各組分與固定液分子間作用力主要是定向力和誘導(dǎo)力，各組分出峰次序按極性順序，極性小的先出峰，極性越大，出峰越慢； b、分離非極性化合物，應(yīng)用非極性固定液，樣品各組分與固定液分子間作用力是色散力，沒有特殊選擇性，這時各組分按沸點順序出峰，沸點低的先出峰。對于沸點相近

50、的異構(gòu)物的分離，效率很低； c、分離非極性和極性化合物的混合物時，可用極性固定液，這時非極性組分先餾出，固定液極性越強，非極性組分越易流出； d、對于能形成氫鍵的樣品。如醇、酚、胺和水的分離，一般選擇極性或氫鍵型的固定液，這時依組分和固定液分子間形成氫鍵能力大小進(jìn)行分離?！跋嗨葡嗳菪栽瓌t”是選擇固定液的一般原則，有時利用現(xiàn)有的固定液不能達(dá)到滿意的分離結(jié)果時，往往采用“混合固定液”，應(yīng)用兩種或兩種以上性質(zhì)各不相同的，按適合比例混合的固定液，使分離有比較滿意的選擇性，又不致使分析時間延長。然而，在實際工作中選擇固定液往往是參考資料或文獻(xiàn)介紹的實例來選用固定液的。（十六）混合固定液的處理方法 混合固

51、定液的處理方法有三種： 、分別涂漬于擔(dān)體后再混合； 、將固定液混合后再涂漬，注意這時所用的固定液都應(yīng)溶解在同一個溶劑里； 、分別涂漬，分別填裝入按比例長短的色譜柱，最后再將它們串接起來。 上述三種處理方法，結(jié)果基本相同，但對于特殊的分離，有些也會有差異。（十七）常用的固定液涂量 由于固定液含量對分離效率的影響很大。所以應(yīng)控制它與擔(dān)體的重量比例，低比例為，一般用。液體比例再大，則被分析的樣品在比較厚的液膜上有擴(kuò)散現(xiàn)象，有損于分離；液體比例太低時，則由于液膜太薄，擔(dān)體表面上殘余的吸附能力會顯示出來，使色譜峰拖尾。由于低比例能促進(jìn)平衡的建立，可以用較高的載氣流速，所以用低的液體比例，再加上少量樣品，

52、能縮短分析時間。對硅藻土擔(dān)體固定液含量可大些；由于氟擔(dān)體表面積較小，所以最多只能；至于玻璃微球由于表面積特小，固定液含量便只能保持在、左右。（十八）配柱時常用的固定液溶劑 常用的溶劑有：甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇、正己烷、石油醚、苯、甲苯和氯仿等等。選用的原則是 、溶解性好， 、不與固定液起化學(xué)反應(yīng)， 、沸點低， 、毒性小。（十九）配柱時在擔(dān)體上涂漬固定液采用的常規(guī)方法 一般配常用的色譜柱，大都采用“常規(guī)”涂漬法，其簡要操作為：取所需量的固定液，用適量（能浸過擔(dān)體）的溶劑溶解，將擔(dān)體緩緩倒入其中，隨到隨攪，而后用紅外燈照射（或用水浴蒸發(fā)）以趕走溶劑，則固定液就附著于擔(dān)體上了。（廿十）色譜柱

53、的常用填充方法 固定相填充的好壞，將直接影響柱效率.通常多用泵抽填充法，即把色譜柱的一端塞上玻璃棉，接真空泵，另一端接一漏斗，在抽吸下加入固定相，邊裝邊敲打色譜柱，至固定相不再進(jìn)入為止。裝好后，塞上玻璃棉。裝柱要求要填充得均勻，緊密，切忌有空隙。（廿一）新裝填的色譜柱老化 裝填好的色譜柱，連接于儀器上后，應(yīng)先試壓，試漏，而后在恒定的溫度下用載氣吹洗數(shù)小時至數(shù)十小時后方可用于分析，一般稱此為柱子的老化過程。老化的目的是把固定相的殘存溶劑，低沸點雜質(zhì)，低分子量固定液等趕走，使記錄器基線平直，并在老化溫度下使固定液在擔(dān)體表面有一個再分布過程，從而涂得更加均勻牢固。裝填好的色譜柱，經(jīng)過老化一段時間后，

54、柱效及性能均穩(wěn)定了，這樣才可使用。六 氣相色譜儀器的使用注意、維修和保養(yǎng)儀器選擇的實驗室其室溫宜在（1035）,相對濕度<85%，室內(nèi)無腐蝕性氣體和強磁場，有排氣裝置、氫氣報警器和去濕設(shè)備，最好有單獨的穩(wěn)壓電源開關(guān)。儀器的儀表發(fā)生故障，可依照儀器使用說明書或線路圖查找原因，排除故障。七 應(yīng)用實例食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定1 原理試樣中六六六、滴滴涕經(jīng)提取，凈化后用氣相色譜法測定，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。電子捕獲檢測器對于負(fù)電及較強的化合物具有極高的靈敏度，利用這一特點，可分別測出痕量的六六六、滴滴涕。不同異構(gòu)體和代謝無可同時分別測定。2 試劑以下未注明級別的試劑，均為分析純。丙酮正乙烷石油

55、醚沸程30oC-60oC。苯硫酸無水硫酸鈉硫酸鈉溶液農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：六六六純度>99%；滴滴涕純度>99%農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取六六六、滴滴涕各10mg，溶于苯中，分別移于100mL容量瓶中，以苯稀釋至刻度，混勻，濃度為100mg/L，貯于冰箱中。農(nóng)藥混和標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別量取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于同一容量瓶中，以正乙烷稀釋至刻度。 3 儀器氣相色譜儀：具電子捕獲檢測器和微處理機旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器N-蒸發(fā)器勻漿機GB/T 5009.19-2003調(diào)速多用振蕩器離心機植物樣本粉碎機4 分析步驟4.1試樣準(zhǔn)備谷類制成粉末，其制品制成勻漿；蔬菜，水果及其制品制成勻漿；蛋品去殼制成勻漿；肉品去皮筋后，切成小塊，制成肉糜；鮮乳混勻待用。4.2提取4.2.1稱取具有代表性的各類食品試樣勻漿20g，加水5mL（視其水分含量加水，使其總水量約20mL），加丙酮40mL，振蕩30min，加氯化鈉6g，搖勻。加石油醚30mL，再振蕩30min，靜止分層。取上清夜35mL經(jīng)無水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，以石油醚定容至5mL，加濃硫酸0.5mL凈化，振搖0.5min，于3000r/min離心15min。取上清夜進(jìn)行GC分析。4.2.2稱取具有代表性的2g粉末試樣