(翻譯(獨(dú)家首發(fā)一種生物抗氧化劑-α-硫辛酸

1、一種生物抗氧化劑 -硫辛酸Lester Packer,* Eric H. Witt,* Hans Jurgen Tritschler* 美國加利福尼亞州伯克利市加利福尼亞大學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)系，膜生物能研究組 德國法蘭克福市，ASTA醫(yī)學(xué)院（1994年10月24日收稿，1994年12月16日修回，1994年12月20日接收）Lester Packer博士是伯克利市加利福尼亞大學(xué)分子和細(xì)胞生物學(xué)系教授。1956年他獲得耶魯大學(xué)微生物學(xué)和生物化學(xué)博士學(xué)位。在伯克利，自1961年開始擔(dān)任生理學(xué)教授，伯克利加州大學(xué)膜生物能課題組負(fù)責(zé)人，自1972年成為勞倫斯伯克利實(shí)驗(yàn)室高級(jí)科學(xué)家。在生物氧化反應(yīng)和生

2、物能量學(xué)領(lǐng)域，他的研究重點(diǎn)是氧化劑和抗氧化劑在生物系統(tǒng)中的作用。他是世界上從事維生素E和生物抗氧化劑研究的杰出的研究者之一。他最近的研究工作闡明了維生素E生物化學(xué)研究的新領(lǐng)域維生素E循環(huán)。其內(nèi)容主要與維生素E新的酶學(xué)反應(yīng)，維生素E自由基以及維生素E作用后帶來的生物學(xué)后果等幾個(gè)方面有關(guān)。近年來的工作關(guān)注的是抗氧化劑在生物系統(tǒng)中對氧化損傷的預(yù)防，以及維生素E和硫辛酸等抗氧化劑是如何影響基因表達(dá)和細(xì)胞調(diào)控的。這些研究有助于對生物學(xué)抗氧化防御機(jī)制形成新的更寬泛的理解。Packer博士編寫了50多冊書籍，撰寫了500多篇論文，是科學(xué)期刊的8名專業(yè)學(xué)會(huì)會(huì)員之一以及3名編委之一，在他從事的研究領(lǐng)域組織了大量

3、的學(xué)術(shù)會(huì)議。目前，他擔(dān)任加利福尼亞氧氣俱樂部主席，國際自由基研究協(xié)會(huì)主席以及UNESCO分子和細(xì)胞生物學(xué)全球網(wǎng)絡(luò)副主席。通訊作者及地址：Lester Packer，美國，加利福尼亞州94720，伯克利市，加利福尼亞大學(xué)，Life Sciences Addition 251號(hào)摘要 -硫辛酸在線粒體脫氫酶反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，近來它作為一種抗氧化劑，受到人們極大關(guān)注。脂酸或其還原型產(chǎn)物二氫脂酸可與過氧化物自由基，羥自由基，次氯酸，過氧化氫以及單線態(tài)氧等反應(yīng)氧簇發(fā)生反應(yīng)。脂酸也可與維生素C以及谷胱甘肽產(chǎn)生相互作用，繼而使維生素E再循環(huán)利用，從而保護(hù)細(xì)胞膜。除了具有抗氧化活性外，二氫脂酸也可通過還原鐵離

4、子發(fā)揮氧化強(qiáng)化劑的作用。在許多氧化應(yīng)激模型中，給予-硫辛酸進(jìn)行治療已被證實(shí)有益，此類模型包括缺血再灌注損傷，糖尿?。蛐了岷投淞蛐了崤c蛋白均呈疏水性結(jié)合，例如與白蛋白結(jié)合，可阻止糖基化反應(yīng)），白內(nèi)障的形成，HIV激活，神經(jīng)退行性病變，以及自由基損傷。而且，脂酸還可用作一些蛋白氧化還原反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，如肌球蛋白，泌乳素，硫氧還蛋白以及NF-B轉(zhuǎn)錄因子等。我們從如下幾個(gè)方面對脂酸的特性進(jìn)行了綜述：（1）與反應(yīng)氧簇發(fā)生的反應(yīng)；（2）與其他抗氧化劑的相互作用；（3）在氧化應(yīng)激模型或臨床狀況中發(fā)揮的有益效應(yīng)。關(guān)鍵詞 抗氧化劑，二氫脂酸，二氫硫辛酸，-脂酸，-硫辛酸，氧化應(yīng)激，氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)，綜述，硫辛

5、酸，自由基介紹-硫辛酸的新陳代謝作用為人們所認(rèn)識(shí)已有數(shù)十年。它最初是作為一種醋酸取代因子由Reed及其同事分離得到1，2，溶于水，但也溶于有機(jī)溶劑。它有多個(gè)名字，包括硫辛酸；1，2-二硫戊環(huán)基-3-戊酸；1，2-二硫戊環(huán)基-3-戊酸以及6，8-二巰基辛酸。-硫辛酸為硫辛酰胺，它在多酶復(fù)合物中的作用為一種輔助因子，可催化-酮酸類發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)，這些酮酸類物質(zhì)包括丙酮酸，-酮戊二酸以及支鏈-酮酸3。-硫辛酸分離得到后曾暫時(shí)被歸為維生素類物質(zhì)1，4，但后來發(fā)現(xiàn)它是由動(dòng)物和人體合成的5；但是，目前尚未闡明可進(jìn)行重新合成的完全酶學(xué)途徑。多項(xiàng)研究表明，辛酸是八碳脂肪酸鏈的中間體，半胱氨酸可能提供了硫基的

6、來源6。最近，-硫辛酸及其還原型二氫硫辛酸（DHLA，圖1）可能具有抗氧化功能引起了人們極大地關(guān)注。在本綜述中，我們重點(diǎn)論述了這些化合物的抗氧化特性，以及基于對這一老的輔酶的新鮮認(rèn)識(shí)可能帶來的預(yù)防和治療應(yīng)用前景?？寡趸瘎┑臉?biāo)準(zhǔn)評價(jià)一種化合物的抗氧化能力時(shí)必須考慮多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。其中一些標(biāo)準(zhǔn)涉及化合物的化學(xué)性質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)： -硫辛酸 二氫硫辛酸圖1. -硫辛酸和二氫硫辛酸的結(jié)構(gòu)，分別為化學(xué)結(jié)構(gòu)（上圖），球-棒模型（中圖），空間填充模型（下圖）。圖中也顯示了天然存在的R-對映體。合成的-硫辛酸是R-和S-對映體的外消旋混合物。l 抑制自由基的特性l 螯合金屬的活性l 與其他抗氧化劑的相互作用l 對基

7、因表達(dá)的影響考慮到疾病預(yù)防或治療用途時(shí)，其他標(biāo)準(zhǔn)也非常重要：l 吸收情況及生物利用度l 在組織，細(xì)胞和細(xì)胞外液中的濃度l 分布（在水相中還是膜結(jié)構(gòu)中，還是兩者兼而有之？）一種物質(zhì)無需滿足上述所有的標(biāo)準(zhǔn)才可認(rèn)定為一種良好的抗氧化劑。例如，維生素E只在膜上或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域中才發(fā)揮作用，其突出的作用是抑制脂質(zhì)過氧化自由基，對于水相中的自由基的作用微乎其微或根本沒有活性，然而，維生素E依然被認(rèn)為是機(jī)體重要的抗氧化劑之一。流行病學(xué)研究證實(shí)維生素E可以預(yù)防許多氧化相關(guān)的疾病，例如心臟病7，8。一種“理想的”抗氧化劑應(yīng)滿足上述所有標(biāo)準(zhǔn)。-硫辛酸/二氫硫辛酸氧化還原對比較接近這種理想狀況；它一直被稱為“萬能抗氧化

8、劑”9。-硫辛酸易于從食物中吸收。在很多組織中，它迅速轉(zhuǎn)化成DHLA，近來在分析技術(shù)方面取得的進(jìn)展已清楚地證實(shí)了這一點(diǎn)10，11。該氧化還原對中的一個(gè)組分或兩者皆可有效地抑制脂質(zhì)和水相中的大量自由基。DHLA21，32，33和-硫辛酸13，19，23，24均具有螯合金屬的活性。DHLA可與其他抗氧化劑發(fā)生協(xié)同作用，說明它能夠使其他抗氧化劑從基態(tài)或失活態(tài)中再生。最后，有證據(jù)顯示，該氧化還原對調(diào)節(jié)性蛋白以及參與機(jī)體正常生長代謝的基因可能有作用?？紤]到這些抗氧化劑的作用，目前開展了大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究，這些研究表明，-硫辛酸作為一種治療藥物對于下述疾病非常有用或具有潛在應(yīng)用價(jià)值，如糖尿病，缺血-

9、再灌注損傷，重金屬中毒，輻射損傷，神經(jīng)退行性病變以及HIV感染等?？寡趸瘎┑淖饔迷缭?959年，Rosenberg和Culik就發(fā)現(xiàn)了-硫辛酸的抗氧化作用4，他們觀察到給予-硫辛酸能夠預(yù)防維生素C缺乏型豚鼠的壞血病癥狀，也能夠預(yù)防大鼠的維生素E缺乏癥狀，這些大鼠的飼料中不含-生育酚。然而，直到最近才開始研究-硫辛酸和DHLA在自由基淬滅，金屬螯合，抗氧化劑再循環(huán)以及基因表達(dá)等方面的特定作用。反應(yīng)氧簇淬滅及金屬螯合作用硫辛酸 人們對于-硫辛酸的抗氧化作用基本有共識(shí)。它能夠清除羥自由基，次氯酸和單線態(tài)氧。但它不能清除過氧化氫或超氧自由基，可能也不能清除過氧基（表1）。-硫辛酸可以螯合過渡態(tài)金屬。兩

10、項(xiàng)研究表明-硫辛酸是一種有效的羥自由基清除劑。在其中一項(xiàng)研究中12，羥自由基由2 mM H2O2 + 0.2 mM FeSO4反應(yīng)生成。利用自旋捕獲劑5，5-二甲基喹啉-N-氧化物（DMPO），通過電子自旋共振（ESR）對自由基進(jìn)行檢測。1 mM -硫辛酸可完全消除DMPO-OH的加和物信號(hào)。在另外一項(xiàng)研究中13，使用相似的羥自由基生成體系（2.8 mM H2O2，0.05 mM FeCl3，0.1 mM EDTA，以及0.1 mM 抗壞血酸），但采用了不同的自由基分析方法（脫氧核糖降解法），結(jié)果也發(fā)現(xiàn)-硫辛酸是一種羥自由基清除劑。在該研究中，計(jì)算得出速率常數(shù)為4.7 × 1010

11、M-1s-1；這基本上是擴(kuò)散限制的反應(yīng)速率。因此，-硫辛酸是一種非常有效的羥自由基清除劑。關(guān)于-硫辛酸清除次氯酸的能力也有類似的共識(shí)。Haenen和Bast14以及Scott等13均發(fā)現(xiàn)50 M -硫辛酸幾乎可完全消除50 M 次氯酸所致的1-抗蛋白酶的失活。這種表現(xiàn)與谷胱甘肽的作用大不相同，谷胱甘肽的還原型是非常有力的次氯酸清除劑，作用與-硫辛酸相當(dāng)，但是其氧化型幾乎完全無效14。該研究的作者推測，-硫辛酸相比氧化型谷胱甘肽的表現(xiàn)出更高的反應(yīng)性可能與其分子內(nèi)二硫化物結(jié)構(gòu)中五元環(huán)略顯緊張的構(gòu)象有關(guān)系；在谷胱甘肽的分子內(nèi)二硫化物結(jié)構(gòu)中沒有這樣的張力，這一點(diǎn)或可解釋在該系統(tǒng)中谷胱甘肽反應(yīng)性不足的問

12、題。目前發(fā)現(xiàn)，-硫辛酸至少在四個(gè)不同系統(tǒng)中可以清除單線態(tài)氧。兩項(xiàng)早期的研究表明，-硫辛酸可與紅熒烯自動(dòng)氧化15或亞甲基感光氧化16生成的單線態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)；這些實(shí)驗(yàn)在有機(jī)溶劑中開展。后來在更接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行的研究也證實(shí)-硫辛酸是一種有效的單線態(tài)氧清除劑。Kaiser等17通過內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。在該系統(tǒng)中，-硫辛酸與單線態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)，速率常數(shù)為1.38 × 108 M-1s-1。還有一些實(shí)驗(yàn)利用內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過單鏈DNA斷裂進(jìn)行檢測，在這些系統(tǒng)中也證實(shí)-硫辛酸是一種單線態(tài)氧清除劑18，19。早期的化學(xué)研究也表明-硫辛酸能夠與

13、過氧化氫發(fā)生反應(yīng)20。只是在這些研究中使用的是高濃度的過氧化氫（30%）以及在非生理?xiàng)l件下進(jìn)行（例如在丙酮中進(jìn)行一天反應(yīng)）。當(dāng)-硫辛酸與過氧化氫在水溶性環(huán)境中進(jìn)行測試時(shí)13，沒有發(fā)生反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)采用基于過氧化物酶的分析系統(tǒng)檢測過氧化氫，-硫辛酸的測試濃度最高達(dá)6 mM。兩項(xiàng)獨(dú)立的研究均未證實(shí)-硫辛酸可以清除超氧自由基。兩項(xiàng)研究均利用黃嘌呤或次黃嘌呤以及黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧自由基。其中一項(xiàng)研究利用自旋捕獲劑DMPO，通過電子自旋共振（ESR）對超氧自由基進(jìn)行檢測12，未見反應(yīng)（圖2）。無獨(dú)有偶，Scott等人利用細(xì)胞色素c還原反應(yīng)檢測超氧化物，同樣也發(fā)現(xiàn)-硫辛酸沒有作用。表1 -硫辛酸的抗氧化作用

14、氧化劑能否被-硫辛酸清除？試驗(yàn)系統(tǒng)參考文獻(xiàn)超氧自由基不能不能通過黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，利用自旋捕獲劑以電子自旋共振法進(jìn)行檢測通過次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，通過超氧陰離子依賴的細(xì)胞色素c還原法進(jìn)行檢測1213過氧化氫不能直接加入過氧化氫并通過過氧化物酶分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測13羥自由基可以可以利用H2O2 + FeSO4反應(yīng)生成羥自由基，利用自旋捕獲劑通過電子自旋共振對自由基進(jìn)行檢測，或利用氨基苯二酰肼通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測利用H2O2 + FeCl3+抗壞血酸生成羥自由基，通過脫氧核糖降解法進(jìn)行檢測。反應(yīng)速率常數(shù) = 4.71 × 1010 M-1s-11213次

15、氯酸自由基可以可以直接加入次氯酸并通過影響1抗蛋白酶活性進(jìn)行檢測同上1413過氧基不能可以利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二鹽酸鹽（AAPH）在水溶性介質(zhì)中生成過氧基，通過藻紅蛋白熒光淬滅法進(jìn)行檢測。在脂質(zhì)（脂質(zhì)體或大鼠肝臟微粒體）中，通過2，2偶氮（二異庚腈）（AMVN）的熱解反應(yīng)生成過氧基。通過線性加速器生成CCl3O2-并利用分光光度法進(jìn)行檢測。反應(yīng)速率常數(shù)為1.8 × 108 M-1s-1913單線態(tài)氧可以可以可以可以在空氣飽和苯中，于546 nm處激發(fā)，由紅熒烯自動(dòng)氧化生成單線態(tài)氧，根據(jù)隨后紅熒烯光譜消失進(jìn)行檢測。反應(yīng)速率常數(shù) = 1 × 108 M-1s-1，

16、未對DHLA進(jìn)行試驗(yàn)。在氯仿或甲醇中由亞甲基感光氧化生成單線態(tài)氧；通過分析硫辛酸甲酯的氧化產(chǎn)物檢測反應(yīng)情況。未對DHLA進(jìn)行試驗(yàn)。通過內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。在該系統(tǒng)中，-硫辛酸與單線態(tài)氧發(fā)生反應(yīng)的速率常數(shù) = 1.38 × 108 M-1s-1。利用內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過單鏈DNA斷裂進(jìn)行檢測15161718，19過渡金屬螯合劑螯合劑可能為螯合劑沒有螯合作用螯合劑螯合劑在水溶液中-硫辛酸能夠與Mn2+，Cu2+，Zn2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Bisnorlipoate和tetralipoate可與離子形成更加穩(wěn)定的復(fù)合物與測試單線態(tài)氧的

17、系統(tǒng)相同。當(dāng)向系統(tǒng)中加入EDTA時(shí)，-硫辛酸的保護(hù)作用降低，說明其保護(hù)效應(yīng)至少部分是通過金屬螯合作用達(dá)到的。-硫辛酸在肝細(xì)胞中能夠降低Cd2+誘導(dǎo)的毒性，但效能遠(yuǎn)不及DHLA。作者推測硫辛酸被攝取并轉(zhuǎn)化為DHLA，后者才是發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的化合物在大鼠肝臟微粒體 + 硫酸亞鐵 + 抗壞血酸中，硫辛酸對于TBARS的蓄積沒有作用-硫辛酸能夠抑制鐵離子誘導(dǎo)的脫氧核糖的位點(diǎn)特異性降解，說明硫辛酸能夠螯合鐵離子。降低銅離子催化的抗壞血酸氧化反應(yīng)，增加銅離子由水相轉(zhuǎn)入正辛醇中的比例，抑制銅離子誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)231621221324-硫辛酸是否具有清除過氧基的能力尚不十分明確。一個(gè)研究小組報(bào)道9，-硫辛

18、酸在水溶性或脂溶性環(huán)境中均不會(huì)與過氧基發(fā)生反應(yīng)。過氧基利用不耐熱的偶氮引發(fā)劑生成，利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二鹽酸鹽（AAPH）在水溶性介質(zhì)中生成過氧基，或者利用2，2偶氮（二異庚腈）（AMVN）在脂溶性介質(zhì)中生成過氧基。通過藻紅蛋白熒光衰退法檢測水溶性環(huán)境中的過氧基，在脂質(zhì)（脂質(zhì)體或大鼠肝臟微粒體）中，通過TBARS或共軛二烯分析法檢測過氧基。與此相反，另外一個(gè)研究小組13只采用了水溶性系統(tǒng)，通過四氯化碳和異丙醇輻射分解反應(yīng)生成過氧基（CCl3O2-），他們發(fā)現(xiàn)-硫辛酸可以與該自由基發(fā)生反應(yīng)，速率常數(shù)為1.8 × 108 M-1s-1，利用分光光度計(jì)測量跟蹤反應(yīng)情況。對這種

19、差異作出的解釋可能是兩個(gè)研究小組采用的方法學(xué)不同，但仍需進(jìn)一步的工作以澄清這一問題。-硫辛酸也有可能通過過渡金屬螯合作用在生物系統(tǒng)中發(fā)揮抗氧化作用。曾發(fā)現(xiàn)-硫辛酸在分離的肝細(xì)胞中能夠降低Cd2+誘導(dǎo)的毒性，然而，作者推測這一作用是由于-硫辛酸轉(zhuǎn)化為DHLA所產(chǎn)生，DHLA是真正的螯合劑21。有兩項(xiàng)研究表明-硫辛酸可以螯合鐵離子，但還有一項(xiàng)研究表明它沒有該作用。Devasagayam等發(fā)現(xiàn)19，當(dāng)向系統(tǒng)中加入EDTA時(shí)-硫辛酸的效力較低，說明其部分效應(yīng)是由于鐵離子螯合所致，該研究小組曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)-硫辛酸可有效抑制單線態(tài)氧誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂。Scott等13發(fā)現(xiàn)，-硫辛酸通過氯化鐵/過氧化氫/抗壞血

20、酸抑制脫氧核糖的位點(diǎn)特異性降解，說明-硫辛酸能夠清除結(jié)合到脫氧核糖的鐵離子。與此相反，在大鼠肝臟微粒體系統(tǒng)中，通過硫酸亞鐵誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)22，研究發(fā)現(xiàn)-硫辛酸不能抑制過氧化。因此，在這一領(lǐng)域同樣也需要進(jìn)行深入的研究。-硫辛酸能夠與Mn2+，Cu2+，Zn2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這些復(fù)合物幾乎全都有羧基23。這些研究者還考察了離子與bisnorlipoate和tetralipoate形成的復(fù)合物，兩者分別是-硫辛酸少兩個(gè)碳和四個(gè)碳的同系物。研究發(fā)現(xiàn)這些復(fù)合物比與-硫辛酸形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定，可能是因?yàn)楦痰奶兼溤试S二硫戊環(huán)也參與了螯合反應(yīng)。近來已將-硫辛酸對銅的作用延伸到氧化作用。-硫辛酸能夠

21、有效阻止銅離子催化的抗壞血酸氧化反應(yīng)，增加銅離子由水相轉(zhuǎn)入正辛醇中的比例，抑制銅離子催化的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)24。上述觀察結(jié)果表明-硫辛酸是一種銅離子螯合劑?？傊?硫辛酸可以清除羥自由基，次氯酸，以及單線態(tài)氧，但對過氧化氫和超氧自由基無效。它能夠螯合鐵，銅及其他過渡金屬。仍需進(jìn)一步的研究以證實(shí)-硫辛酸是否可清除過氧基。圖2. 電子自旋共振法研究-硫辛酸和二氫硫辛酸對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的超氧陰離子的作用。DMPO電子自旋加和物生成方法：5 mM 黃嘌呤（X）+ 100 g 黃嘌呤氧化酶（XO）于150 mM KH2PO4-KOH（pH 7.4）中，在存在40 M DETAPAC環(huán)境中生成，總

22、體積：1 ml DHPO=45 mM ；SOD = 200 U；-硫辛酸 (TA) = 5 mM；二氫硫辛酸 (DHLA) = 5 mM.。黃嘌呤氧化酶反應(yīng)啟動(dòng)后，記錄ESR信號(hào)3分鐘。二氫硫辛酸 二氫硫辛酸/-硫辛酸氧化還原對的氧化還原電位為-0.32 V（參考25），因此二氫硫辛酸是一種有效的還原劑；作為比較，還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的氧化還原電位為-0.24 V（參考26），二氫硫辛酸能夠?qū)SSG還原為GSH，但GSH不能將-硫辛酸還原為二氫硫辛酸27。就像-硫辛酸一樣，二氫硫辛酸也是一種有效的抗氧化劑，但是關(guān)于它的效應(yīng)有更多不確定性（表2）。目前一致的看法是，DHLA能夠清除次

23、氯酸，過氧基，并有可能清除羥自由基。它不能與過氧化氫或單線態(tài)氧反應(yīng)。但是，關(guān)于DHLA是否也能清除超氧自由基以及在其與鐵離子的相互作用中DHLA到底是抗氧化劑還是促氧化劑等問題上，研究結(jié)論尚不一致。在檢測-硫辛酸與次氯酸離子反應(yīng)的系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)DHLA也有效，且清除自由基能力大致相同14。在多個(gè)不同的系統(tǒng)中，DHLA均被證明是一種有效的過氧基清除劑。如在-硫辛酸實(shí)驗(yàn)中所述，Kagan等9利用AAPH或AMVN分別在水相或脂質(zhì)中產(chǎn)生過氧基，但是，與-硫辛酸不同，在這些系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)二氫硫辛酸能夠清除過氧基。研究還發(fā)現(xiàn)，DHLA能夠清除脂質(zhì)中由AMVN產(chǎn)生的過氧基，并可通過十八碳四烯酸的熒光衰退檢測到2

24、8，也能夠清除如-硫辛酸測試時(shí)所述的在水溶液中產(chǎn)生的CCl3O2-，在后面這一系統(tǒng)中，計(jì)算二氫硫辛酸與自由基發(fā)生反應(yīng)的速率常數(shù)為2.7 × 107 M-1s-1。在生成羥自由基的系統(tǒng)中，DHLA既有抗氧化作用12，又有促氧化作用13；但是，如果情形確實(shí)如此，促氧化作用則可能與DHLA對鐵離子的作用有關(guān)（參見后文）。兩組都用鐵鹽和過氧化氫產(chǎn)生羥自由基。Suzuki等12利用DMPO生產(chǎn)自旋加和物，通過電子自旋共振法檢測羥自由基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHLA能夠消除DMPO-OH信號(hào)；Scott等13通過脫氧核糖降解法檢測羥自由基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入DHLA后能夠增強(qiáng)上述反應(yīng)過程。研究結(jié)果之所以有差異，可

25、能是因?yàn)镾cott等使用抗壞血酸還原三價(jià)鐵離子，而Suzuki等使用二價(jià)鐵鹽，而并未使用抗壞血酸；DHLA使抗壞血酸再循環(huán)（見后文），因此在該系統(tǒng)中促進(jìn)了抗壞血酸作為還原劑的功效。Scott等推測這種三價(jià)鐵離子直接還原的機(jī)制是導(dǎo)致DHLA促氧化效應(yīng)的原因。然而，如果DHLA是通過高鐵離子的直接還原反應(yīng)發(fā)揮作用，則Suzuki等應(yīng)當(dāng)也能觀察到促氧化效應(yīng)，但是他們并未觀察到。無論如何，DHLA可清除羥自由基，在某些產(chǎn)生羥自由基的系統(tǒng)中也有可能觀察到促氧化效應(yīng)。表2 二氫硫辛酸的抗氧化作用氧化劑能否被-硫辛酸清除？試驗(yàn)系統(tǒng)參考文獻(xiàn)超氧自由基可以不能通過黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，利用自旋捕獲

26、劑以電子自旋共振法進(jìn)行檢測。反應(yīng)中DHLA的巰基含量下降，而過氧化氫濃度升高。反應(yīng)速率常數(shù) = 3.3 × 105 M-1s-1通過次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，通過腎上腺素氧化反應(yīng)進(jìn)行檢測。反應(yīng)速率常數(shù) = 7.3 × 105 M-1s-1通過次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，通過超氧陰離子依賴的四唑藍(lán)還原法進(jìn)行檢測122813過氧化氫不能不能直接加入過氧化氫，并通過鐵離子-硫氰酸鹽進(jìn)行檢測直接加入過氧化氫，通過測量DHLA中的巰基含量監(jiān)測反應(yīng)2913羥自由基可以不能（促進(jìn)氧化反應(yīng)）利用H2O2 + FeSO4反應(yīng)生成羥自由基，利用自旋捕獲劑通過電子自旋共振對

27、自由基進(jìn)行檢測利用H2O2 + FeCl3+抗壞血酸生成羥自由基，通過脫氧核糖降解法進(jìn)行檢測。推測促氧化效應(yīng)是由于亞鐵離子還原以及/或者DHLA使抗壞血酸再循環(huán)所致1213次氯酸自由基可以可以直接加入次氯酸并通過影響1抗蛋白酶活性進(jìn)行檢測同上1413過氧基可以可以可以利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二鹽酸鹽（AAPH）在水溶性介質(zhì)中生成過氧基，通過藻紅蛋白熒光淬滅法進(jìn)行檢測。在脂質(zhì)（脂質(zhì)體或大鼠肝臟微粒體）中，通過2，2偶氮（二異庚腈）（AMVN）的熱解反應(yīng)生成過氧基。計(jì)量方法：每摩爾DHLA淬滅1.5 mol 過氧基與Kagan等于1992年的研究方法相同。此外，在脂質(zhì)體中利用AMVN生成

28、過氧基，通過姜餅樹酸的熒光衰退法進(jìn)行檢測。通過線性加速器生成CCl3O2-并利用分光光度法進(jìn)行檢測。反應(yīng)速率常數(shù)為2.7 × 107 M-1s-192813單線態(tài)氧不能可以（？）通過內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。利用內(nèi)過氧化物散熱作用產(chǎn)生單線態(tài)氧，并通過單鏈DNA斷裂進(jìn)行檢測。DHLA的保護(hù)效應(yīng)可能并非是由于直接消除單線態(tài)氧。1718，19過渡金屬螯合作用螯合作用促氧化劑促氧化劑沒有促氧化作用部分促氧化作用促氧化劑二氫硫辛酸在離體肝細(xì)胞中能夠降低Cd2+誘導(dǎo)的毒性。也可降低暴露于Cd2+的肝細(xì)胞中的TBARS含量，研究表明，沒有添加鐵離子時(shí)，DHLA的活性

29、全都是對抗過氧化反應(yīng)的抗氧化活性（與Bast和Haenen，Scott等人的研究不同）。DHLA可以結(jié)合來自亞鐵和高鐵狀態(tài)的鐵蛋白中的鐵離子在氯化鐵-EDTA +過氧化氫系統(tǒng)中，可加速脫氧核糖降解。系統(tǒng)中不含EDTA時(shí)，反應(yīng)也加速，說明DHLA的鐵離子結(jié)合作用不像其鐵離子還原作用那樣有效。但是，當(dāng)DHLA單獨(dú)用于三價(jià)鐵-博萊霉素-DNA系統(tǒng)時(shí)未見促氧化作用在大鼠肝臟微粒體 + 硫酸亞鐵 + 抗壞血酸中，通過TBARS檢測，發(fā)現(xiàn)DHLA可促進(jìn)氧化反應(yīng)通過Fe2+-鄰二氮菲復(fù)合物測量發(fā)現(xiàn)，從DHLA向三價(jià)鐵離子沒有發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。另外，在硫酸亞鐵-過氧化氫體系中，通過電子自旋共振（DMPO電子捕獲劑

30、）檢測發(fā)現(xiàn)，DHLA也不會(huì)促進(jìn)羥自由基的形成。在脂質(zhì)體有AMVN誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中，沒有鐵離子的情況下（鐵離子被去鐵胺螯合），DHLA能夠降低50%的過氧化反應(yīng)（通過TBARS測量到）。有鐵離子的情況下，DHLA不會(huì)降低過氧化反應(yīng)（但是，并沒有促氧化效應(yīng)，即，在該系統(tǒng)中DHLA的抗氧化作用和促氧化作用保持平衡）。在該系統(tǒng)中，有鐵離子存在時(shí)，Tetranor-DHLA能夠極大地促進(jìn)過氧化反應(yīng)（5倍）。存在銅離子時(shí)，微摩爾DHLA可導(dǎo)致pSP64質(zhì)粒DNA單鏈斷裂。在相同的檢測體系中也檢驗(yàn)了其他的金屬離子，沒有任何作用：包括Co2+，Cr2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Ni2+，Mn2+以及Zn2+

31、。在該體系中，存在銅離子時(shí)，發(fā)現(xiàn)其他的巰基化合物也能導(dǎo)致DNA斷裂。2132，331322122834在與測定-硫辛酸與過氧化氫反應(yīng)相似的體系中13，29，未發(fā)現(xiàn)DHLA有反應(yīng)。此外，Kaiser等17利用紅外化學(xué)發(fā)光法檢測單線態(tài)氧時(shí)，沒有檢測到DHLA對單線態(tài)氧的清除作用。與此相反，DHLA的確能夠阻止單線態(tài)氧誘發(fā)的單鏈DNA斷裂（與促進(jìn)DNA斷裂的谷胱甘肽不同），但是，這種作用不一定是由于清除單線態(tài)氧，因?yàn)樵谶@一過程中DHLA還可能在多個(gè)步驟發(fā)揮這一作用18，19。既然紅外化學(xué)發(fā)光這種更加直接檢測單線態(tài)氧的方法并未檢測到單線態(tài)氧濃度的下降，說明DHLA可能不直接清除單線態(tài)氧。關(guān)于DHLA對

32、超氧自由基的作用，目前有許多，但尚未弄清楚的、不一致的看法。在一項(xiàng)研究中，通過黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，利用自旋捕獲劑以電子自旋共振法對其進(jìn)行檢測12，研究發(fā)現(xiàn)DHLA可與超氧自由基反應(yīng)，反應(yīng)速率常數(shù)為3.3 × 105 M-1s-1（圖2）。分析發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)介質(zhì)中DHLA中的巰基含量降低，而合理的產(chǎn)物過氧化氫含量升高，由此證實(shí)了上述反應(yīng)的發(fā)生。該研究小組后來開展的一項(xiàng)研究也證實(shí)了這些結(jié)果28。后來的研究使用相同的體系生成超氧自由基，通過與腎上腺素氧化反應(yīng)競爭，評價(jià)DHLA的清除能力。在該研究中，反應(yīng)速率常數(shù)為7.3 × 105M-1s-1，與之前的研究結(jié)果取得良好

33、一致。與這些研究不同的是，在另外一組研究中，使用相同的超氧化物生成系統(tǒng)（次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶），通過超氧陰離子依賴的四唑藍(lán)還原法檢測超氧化物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHLA沒有清除超氧化物的作用。目前很難對兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異進(jìn)行解釋，無疑需要開展更深入的研究?；蛟S圍繞DHLA最為關(guān)鍵的問題是在特定條件下它是否是一種促氧化劑。至少有兩種情形可能會(huì)發(fā)生這種情況。其一，DHLA可能是過渡金屬的還原劑，尤其對于鐵離子；其二，DHLA可能使抗壞血酸再循環(huán)，而已知抗壞血酸能夠還原鐵離子。DHLA既可與亞鐵離子Fe2+結(jié)合，也可與高鐵離子Fe3+結(jié)合，并可能將結(jié)合的Fe3+還原為Fe2+ 30，31。DHLA也能夠從處

34、于亞鐵和高鐵狀態(tài)的貯存鐵蛋白中清除鐵離子32，33，但是它不能清除亞鐵血紅素中的鐵離子13。如果DHLA確實(shí)能夠去除鐵離子，并且鐵離子可以發(fā)生反應(yīng)，則在生物系統(tǒng)中必須對DHLA的促氧化效應(yīng)引起認(rèn)真的關(guān)注。實(shí)際上，在大鼠肝臟微粒體的過氧化反應(yīng)22中以及在羥自由基的生成過程中13，DHLA發(fā)揮了促氧化作用。在另外一項(xiàng)研究中，由AMVN啟動(dòng)微粒體中的過氧化反應(yīng)28，當(dāng)系統(tǒng)中含有去鐵胺時(shí)，DHLA，可使過氧化反應(yīng)降低50%，但是當(dāng)沒有去鐵胺時(shí)，DHLA不能降低系統(tǒng)中的過氧化反應(yīng)，這表明有鐵離子存在時(shí)，DHLA的促氧化效應(yīng)平衡了其抗氧化作用。在該研究體系中，一種比DHLA短四個(gè)碳的同系物tetranor

35、-DHLA表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化效應(yīng)，在有鐵離子存在時(shí)，它可使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)升高5倍。此外，DHLA以及許多其他的巰基化合物和二巰基化合物在有銅離子存在時(shí)能夠誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA單鏈斷裂，但在有Fe2+或Fe3+存在時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)DNA單鏈斷裂。這與-硫辛酸的抗氧化銅離子螯合作用相反24。另一方面，在另外一個(gè)檢測體系中，使用鐵離子產(chǎn)生羥自由基，DHLA的作用明確為抗氧化作用12，在該研究中，根據(jù)Fe2+-鄰二氮雜菲復(fù)合物的形成進(jìn)行測量，未觀察到從DHLA到Fe3+有電子轉(zhuǎn)移。在Cd2+誘導(dǎo)的離體肝細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，加入DHLA能夠降低TBARS的量21，因此，至少在該系統(tǒng)中，DHLA對抗脂質(zhì)過氧化的抗氧化效應(yīng)

36、高于任何的促氧化效應(yīng)。因此，DHLA在生物系統(tǒng)中是否為促氧化劑這一問題目前仍未解決。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)系統(tǒng)中含有三價(jià)鐵離子時(shí)，DHLA可能促進(jìn)羥自由基的形成，但是還未知其生理學(xué)意義。抗壞血酸在體外也能將高鐵離子還原為亞鐵離子；實(shí)際上，在體外系統(tǒng)中，抗壞血酸+ Fe3+是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)劑，但是在體內(nèi)正常條件下，鐵離子結(jié)合非常牢固，抗壞血酸的這種效應(yīng)可能并不重要。DHLA的情況可能也是如此，但是DHLA可能從鐵蛋白中去除結(jié)合型鐵離子的情況應(yīng)引起注意。更進(jìn)一步，在生理系統(tǒng)中，DHLA與其他抗氧化劑的相互作用可能消除促氧化效應(yīng)。例如，在Bast和Haenen進(jìn)行的研究中23，DHLA能夠促進(jìn)亞鐵離

37、子誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，抗壞血酸也可以。然而，與不含DHLA的相同系統(tǒng)相比，當(dāng)系統(tǒng)中存在抗壞血酸，谷胱甘肽，亞鐵離子時(shí)，DHLA 就會(huì)表現(xiàn)出抗氧化效應(yīng)。-硫辛酸和二氫硫辛酸的這些研究結(jié)果明確了將來開展研究的幾個(gè)重要領(lǐng)域：（1）-硫辛酸針對過氧基的抗氧化作用；（2）DHLA對超氧自由基的作用；（3）DHLA對鐵離子和其他過渡金屬的作用。此外，由于-硫辛酸和二氫硫辛酸具有不同的抗氧化作用，因此必須闡明-硫辛酸在不同組織的攝取和還原作用。與其他抗氧化劑的相互作用DHLA能夠使其他抗氧化劑例如抗壞血酸，維生素E(間接地)等以自由基形式再循環(huán)。維生素E是主要的鏈斷裂抗氧化劑，可保護(hù)膜免于脂質(zhì)過氧化35。在生

38、物膜中，維生素E與不飽和磷脂之間的摩爾比很低，通常每毫克膜蛋白含有不到0.1 nmol 維生素E，或者換句話說，每1000到2000個(gè)膜磷脂分子才有一個(gè)維生素E分子，磷脂是膜內(nèi)主要的氧化靶點(diǎn)。在生物膜中，脂質(zhì)過氧化自由基的生成速率為每分鐘每毫克膜蛋白產(chǎn)生1-5 nmol，而膜磷脂通常不會(huì)發(fā)生破壞性的氧化反應(yīng)，維生素E也不會(huì)迅速耗竭。而且，在成年動(dòng)物中，維生素E缺乏狀態(tài)非常難以誘導(dǎo)。這些看似自相矛盾的結(jié)論可以用“維生素E再循環(huán)利用”進(jìn)行解釋，在其再循環(huán)過程中，維生素E的抗氧化能力繼續(xù)被其他的抗氧化劑所貯存。那些可以使維生素E再循環(huán)的抗氧化劑有維生素C ，還原型泛醌以及巰基化合物（圖3）36，37

39、。許多研究提供了DHLA使維生素E再循環(huán)的證據(jù)。DHLA能夠保護(hù)微粒體免于脂質(zhì)過氧化，但是只有存在維生素E時(shí)才如此38；在正常微粒體中而非維生素E缺乏型微粒體中，在低水平化學(xué)發(fā)光開始，維生素E減少以及硫代巴比妥酸迅速累積之前，DHLA可以延長保護(hù)時(shí)相。-硫辛酸在上述任一系統(tǒng)中均無效。在該系統(tǒng)中，DHLA可能通過直接減少酚氧自由基或通過減少其他抗氧化劑（如抗壞血酸）而發(fā)揮作用，進(jìn)而使維生素E再循環(huán)。DHLA與酚氧自由基之間可能存在微弱的直接相互作用；我們發(fā)現(xiàn)，在暴露與紫外光下的脂質(zhì)體中，DHLA的存在能夠降低酚氧自由基的電子自旋共振信號(hào)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。用紫外光線可直接產(chǎn)生酚氧自由基，消除DHLA

40、螯合鐵離子的可能性或DHLA其他的抗氧化效應(yīng)，使用脂質(zhì)體則消除了DHLA通過其他抗氧劑發(fā)揮作用的可能性。因此，在該系統(tǒng)中，主要分布于水相中的DHLA似乎在膜/水臨界處直接減少酚氧自由基。然而這種效應(yīng)很微弱，在生物系統(tǒng)中由DHLA引起的維生素E的大多數(shù)再生循環(huán)可能是通過其他的抗氧化劑實(shí)現(xiàn)的。Basthe 和Haenen39提出DHLA通過還原谷胱甘肽阻止脂質(zhì)過氧化，然后使維生素E再循環(huán)利用。這種提議依據(jù)如下觀察結(jié)果，DHLA與氧化型谷胱甘肽聯(lián)合作用時(shí)可以預(yù)防Fe2+/抗壞血酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，而DHLA單獨(dú)無此作用22。另一方面，Kagan等9提出，DHLA通過使抗壞血酸再循環(huán)進(jìn)而使維生素E再循

41、環(huán)，保護(hù)脂膜免于氧化。他們的電子自旋共振研究證實(shí)了DHLA介導(dǎo)的維他命C自由基的減少，維他命C自由基是在抗壞血酸氧化過程中由生育酚氧（維生素E或短鏈維生素E同系物）自由基在DOPC脂質(zhì)體中生成，另外研究也證實(shí)DHLA可與NADPH-或NADH依賴的電子傳遞鏈相互作用，促使維生素E再循環(huán)。在人類低密度脂蛋白40和紅細(xì)胞膜中41也曾觀察到DHLA介導(dǎo)的依賴抗壞血酸的維生素E再循環(huán)。此外，有證據(jù)顯示，面對氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)給予-硫辛酸時(shí)能夠升高還原型泛醌的水平41a，已知泛醌可使維生素E再循環(huán)41b?？傊?，現(xiàn)有證據(jù)指出，DHLA可以通過谷胱甘肽，維他命C，泛醌，NADPH或NADH使維生素E再循環(huán)，

42、但是不同途徑對于維生素E再循環(huán)的相對貢獻(xiàn)尚不明確。實(shí)際上，早在1959年Rosenberg和Culik等就已經(jīng)提出-硫辛酸對其他抗氧化劑的保護(hù)作用4，他們以令人吃驚的預(yù)見性指出，“-硫辛酸以及它進(jìn)入細(xì)胞代謝后轉(zhuǎn)化成的二氫衍生物（作用較-硫辛酸更甚），可能是針對抗壞血酸和生育酚的一種抗氧化劑。”在Rosenberg和Culik進(jìn)行研究中，發(fā)現(xiàn)-硫辛酸既可預(yù)防維生素E缺乏癥狀也可預(yù)防維他命C缺乏癥狀。最近，我們觀察到在生育酚缺乏的裸鼠中給予-硫辛酸后可表現(xiàn)出類似的保護(hù)效應(yīng)42（圖4）。這樣的結(jié)果與-硫辛酸誘導(dǎo)的生育酚和/或抗壞血酸再循環(huán)表現(xiàn)相符，但是，這種表現(xiàn)也可以用-硫辛酸通過其各別的但又重疊的

43、自由基清除效應(yīng)使抗壞血酸和維生素E富余的能力進(jìn)行解釋。圖3. 維生素E的再循環(huán)。在-生育酚氧化過程（在膜內(nèi)所示）中形成的酚氧自由基可以被很多化合物再還原回到-生育酚，這些化合物包括泛醌，細(xì)胞色素c以及抗壞血酸?？箟难峥梢酝ㄟ^與谷胱甘肽或硫辛酸等巰基化合物反應(yīng)再生。依賴NADPH或NADH的還原能力，這些物質(zhì)都可以通過不同的機(jī)制返回到它們的還原型。改編引自科學(xué)美國人。-硫辛酸也可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量升高。Busse等43向小鼠神經(jīng)母細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞系中加入-硫辛酸，觀察到谷胱甘肽含量呈現(xiàn)劑量依賴性升高，相比未加-硫辛酸的對照組升高了30-70%。這些研究者還發(fā)現(xiàn)，小鼠每天腹腔注射4，8，1

44、6 mg/kg -硫辛酸一次，連續(xù)注射11天，在小鼠的肺、肝臟、腎臟細(xì)胞中，谷胱甘肽含量也出現(xiàn)類似的升高。這些結(jié)果在人Jurkat細(xì)胞系研究中也得到證實(shí)，向Jurkat細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入-硫辛酸，5小時(shí)后胞內(nèi)谷胱甘肽的濃度升高了大約50%（D. Han，G. Handelmann，個(gè)人通訊）。GSH含量如此升高不能用GSSG的還原解釋，因?yàn)橥ǔ４嬖诘腉SSG濃度比GSH的濃度低10%44。這些有趣的觀察結(jié)果仍需作出解釋。因此，-硫辛酸和二氫硫辛酸作為抗氧化劑，不僅僅是直接通過自由基淬滅和金屬螯合發(fā)揮作用，也間接地通過其他抗氧化劑的再循環(huán)、以及可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度升高而發(fā)揮作用。蛋白

45、質(zhì)氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)以及對蛋白質(zhì)折疊的影響已報(bào)道蛋白質(zhì)的硫醇化作用是對抗氧化應(yīng)激的一種保護(hù)性機(jī)制，這種作用也會(huì)影響某些含巰基的蛋白質(zhì)的功能44a。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，谷胱甘肽是含量最豐富的巰基化合物44，在正常條件下，它可能是參與蛋白質(zhì)巰基氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)的主要因素。在正常生理?xiàng)l件下，-硫辛酸和二氫硫辛酸不會(huì)以非結(jié)合型存在，但是經(jīng)過食物補(bǔ)充后，兩者均以非結(jié)合型出現(xiàn)在不同的組織中42。DHLA還有比GSH更低的氧化還原電位，此外，它還具有較低的分子量。這些因素可導(dǎo)致如下的可能性：外源性給予-硫辛酸后，不僅可以通過抗氧化作用，還可以通過影響含巰基蛋白的氧化還原狀態(tài)影響細(xì)胞內(nèi)的功能，含巰基的蛋白例如有硫

46、氧還蛋白，酶和運(yùn)輸?shù)鞍椎取６淞蛐了岷投淞蛐刘０纺軌蜻€原硫氧還蛋白47，48，它是一種小分子遍在蛋白，功能是在不同的生化過程中轉(zhuǎn)移電子49。Spector等提出，硫氧還蛋白可能是一種由硫辛酰胺處得到電子的生理學(xué)電子受體。在許多系統(tǒng)中，DHLA能夠增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)76-78，而且認(rèn)為這種刺激可能是由于巰基的還原反應(yīng)所致，而巰基參與胰島素激發(fā)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)過程81。另外還發(fā)現(xiàn)DHLA通過二硫化物還原之外的機(jī)制影響生理意義重要的蛋白質(zhì)。DHLA可將正鐵肌紅蛋白和鐵肌紅蛋白還原為氧合肌紅蛋白45。DHLA還能夠引起腺體激肽釋放酶誘導(dǎo)的催乳素水解，DHLA作用于催乳素，使分子重新折疊為可作為腺體激肽釋

47、放酶的構(gòu)象46。因此，DHLA可能通過抗氧化以外的方式對胞內(nèi)代謝產(chǎn)生影響，但是，這種作用所具備的生理學(xué)意義仍需闡明。圖4. 成年12周齡裸鼠，分別飼以如下飼料6周：（a）正常對照飼料，（b）缺乏維生素E的飼料，（c）缺乏維生素E，補(bǔ)充-硫辛酸的飼料。用缺乏維生素E的飼料飼養(yǎng)的動(dòng)物表現(xiàn)出肌營養(yǎng)不良、體重減輕等維生素E缺乏癥狀。對基因表達(dá)的影響近來關(guān)于氧化劑和抗氧化劑在正常和異常條件下對信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的影響引起人們極大的關(guān)注。考慮到此，我們研究了-硫辛酸和DHLA對轉(zhuǎn)錄因子NF-B的影響51，NF-B能夠調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，例如人免疫缺陷1型病毒基因及參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的那些基因52。另外也考察了-

48、硫辛酸和DHLA對c-fos基因表達(dá)的影響。NF-B通過氧化還原反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)53，54，在調(diào)節(jié)過程中，諸如p50亞單位中Cys62等巰基基團(tuán)十分重要55。在NF-B激活和發(fā)揮作用過程中，有兩個(gè)步驟可能會(huì)受到-硫辛酸等巰基抗氧化劑的影響。早期步驟包括NF-B的激活及其從抑制性亞單位IB解離。顯然這些步驟至少部分處于氧化還原反應(yīng)調(diào)控之下，通過氧化反應(yīng)刺激活化和解離?；罨腘F-B與DNA的結(jié)合有半胱氨酸殘基參與，半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)也非常重要，被還原的半胱氨酸明顯促進(jìn)NF-B與DNA的結(jié)合。所以，含有巰基的抗氧化劑的作用可能很復(fù)雜。例如，硫氧還蛋白過表達(dá)能夠抑制TPA誘導(dǎo)的NF-B活化55a

49、，而在體外系統(tǒng)中，硫氧還蛋白可促進(jìn)NF-B與DNA的結(jié)合55，55b。同樣地，在含有4 mM -硫辛酸的培養(yǎng)基中孵育人Jurkat T細(xì)胞時(shí)，能夠完全抑制腫瘤壞死因子或肉豆蔻酸13-醋酸酯誘導(dǎo)的NF-B激活56。最近有研究發(fā)現(xiàn)，DHLA能夠增強(qiáng)NF-B的DNA結(jié)合活性，而-硫辛酸則抑制NF-B的DNA結(jié)合活性。在非還原環(huán)境中或暴露于巰基氧化劑二酰胺中引起的NF-B DNA結(jié)合抑制作用可被DHLA逆轉(zhuǎn)57。這些化合物之間的相互作用，以及在生理細(xì)胞環(huán)境中它們對于NF-B的影響很難進(jìn)行預(yù)測。有人對-硫辛酸和DHLA對生長調(diào)節(jié)基因c-fos表達(dá)的影響也進(jìn)行了研究58。預(yù)先用-硫辛酸或DHLA孵育過的J

50、urkat T細(xì)胞暴露于TPA中，TPA是一種c-fos基因表達(dá)激活劑。在DHLA中孵育過的細(xì)胞c-fos mRNA的表達(dá)相比對照組減少，而預(yù)先用-硫辛酸孵育過的細(xì)胞c-fos mRNA的表達(dá)相比對照組增多。TPA刺激的培養(yǎng)細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧簇59-61，且TPA刺激的粒白細(xì)胞中超氧化物的生成增多62。DHLA導(dǎo)致c-fos表達(dá)受到抑制，而-硫辛酸并未抑制其表達(dá)，可能是由于DHLA清除了超氧化物，而超氧化物的產(chǎn)生或許可促進(jìn)c-fos的表達(dá)，相反，-硫辛酸不會(huì)清除超氧化物。細(xì)胞凋亡是另外一個(gè)涉及胞內(nèi)氧化反應(yīng)發(fā)揮重要作用的過程。大鼠胸腺細(xì)胞預(yù)先用DHLA或硫辛酰胺進(jìn)行孵育，然后暴露于凋亡誘導(dǎo)劑甲基氫

51、化潑尼松或依托泊苷中，凋亡誘導(dǎo)劑誘發(fā)的細(xì)胞凋亡受到抑制。硫辛酸對此沒有影響（S. Orrenius個(gè)人通訊）。雖然看起來DHLA和/或-硫辛酸可以在一個(gè)或多個(gè)水平上影響基因表達(dá)，但是其確切機(jī)制和意義仍未闡明。該領(lǐng)域具有極大的研究前景。實(shí)驗(yàn)和臨床的治療研究在多種與活性氧自由基有關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸炎C實(shí)服用-硫辛酸已被證實(shí)在多種與活性氧自由基有關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，可有效地的預(yù)防病理學(xué)發(fā)生。然而，在探討這些研究前，有必要討論-硫辛酸是否可以作為飲食補(bǔ)充劑被吸收，可被組織可攝取的程度如何，是否其它在體內(nèi)是否被還原為二氫-硫辛酸二氫硫辛酸，以及是否它是否被代謝為更短鏈的類似物？-硫辛酸的吸收，攝取，細(xì)胞內(nèi)還原和

52、代謝毫無疑問，飲食服用通過膳食補(bǔ)充-硫辛酸對全身生理功能有作用。Rosenberg和Culik4的工作將其解釋清楚對此作出明確闡述，因?yàn)閷?硫辛酸，添加至大鼠和豚鼠的飲食中，緩解了維生素E或維生素C缺乏所表現(xiàn)出的癥狀。隨后的實(shí)驗(yàn)中，63 動(dòng)物飲食喂養(yǎng)補(bǔ)充-硫辛酸12天，檢測肝臟、皮膚和腦勻漿對脂質(zhì)過氧化的敏感性。AMVN誘導(dǎo)的過氧化物的數(shù)量（AMVN孵育40分鐘后測量TBRS）在肝臟降低了79%,在皮膚降低了64%，在腦中降低了50%。這些實(shí)驗(yàn)說明在飲食中添加的-硫辛酸有在組織水平和整體動(dòng)物水平的均具有抗氧化作用，但它們沒能證明-硫辛酸實(shí)際上被完整的吸收。 采用放射性同位素標(biāo)記-硫辛酸的實(shí)驗(yàn)說

53、明該化合物可被吸收。采用皮下注射或或灌胃方式給予大鼠當(dāng)碳14標(biāo)記的-硫辛酸給予大鼠，采用皮下注射或者通過胃管口服的方式，被排泄的藥物和在組織中分布的藥物的總放射活性占給予的總體給藥放射活性的80%。64 即使在消滅了腸道菌群的動(dòng)物中，這也是真實(shí)的情況也是如此，而這些動(dòng)物不太可能吸收由體內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物。接下來的問題是，有多少-硫辛酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二氫-硫辛酸二氫硫辛酸。多種細(xì)胞和組織系統(tǒng)給予了-硫辛酸后，在媒介中以出現(xiàn)在培養(yǎng)介質(zhì)中的是二氫-硫辛酸二氫硫辛酸（DHLA）65出現(xiàn)。65 然而，過去藥物在細(xì)胞內(nèi)的代謝命運(yùn)是未知。最近的一項(xiàng)研究中，10 將14 mM -硫辛酸以濃度從1至4毫摩爾加入至

54、人成纖維細(xì)胞或Jurkat T細(xì)胞的培養(yǎng)基中。采用高效液相色譜（HPLC）和電化學(xué)檢測方法，在不同的時(shí)間檢測對細(xì)胞內(nèi)和組織培養(yǎng)基中，2個(gè)小時(shí)內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的-硫辛酸和二氫-硫辛酸二氫硫辛酸的濃度均使用高效液相色譜（HPLC）合并電化學(xué)進(jìn)行檢測，檢測時(shí)間點(diǎn)最長至2小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10分鐘內(nèi)Jurkat細(xì)胞內(nèi)二氫-硫辛酸二氫硫辛酸的濃度達(dá)1.5毫摩爾。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可釋放二氫-硫辛酸二氫硫辛酸進(jìn)入培養(yǎng)基。這些結(jié)果說明，正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞能攝取-硫辛酸，還原為二氫-硫辛酸二氫硫辛酸，并釋放二氫-硫辛酸二氫硫辛酸。因此，當(dāng)細(xì)胞外單獨(dú)給予-硫辛酸時(shí)，-硫辛酸和二氫-硫辛酸二氫硫辛酸的作用均可在胞內(nèi)和胞外

55、得到體現(xiàn)。這有重要的提示種情況有重要的用途，例如，可使用-硫辛酸補(bǔ)充劑預(yù)防LDL低密度脂蛋白氧化反應(yīng)。最后，一項(xiàng)最近的研究，重復(fù)且延伸了Rosenberg和Culik4的實(shí)驗(yàn)，在維生素E缺陷大鼠上證實(shí)了在組織中-硫辛酸能被吸收并轉(zhuǎn)化為二氫-硫辛酸二氫硫辛酸。42以無毛發(fā)小鼠裸鼠作為模型研究維生素E缺乏條件下，給予或不給予-硫辛酸補(bǔ)充劑的效果，因?yàn)闊o毛發(fā)小鼠裸鼠在5周內(nèi)能表現(xiàn)出明顯的維生素E缺陷癥狀（圖4）。小鼠或喂以正常的飲食飼料，即缺乏維生素E缺乏的飲食飼料；或喂以缺乏維生素E但缺乏同時(shí)按照每千克飼料添加1.65克-硫辛酸/千克的飲食飼料。-硫辛酸補(bǔ)充劑可完全預(yù)防了維生素E缺乏的癥狀。各種飲

56、食以上述不同的飼料喂養(yǎng)小鼠5周后，測量小鼠肝臟、腎臟、心臟和皮膚中-硫辛酸和二氫-硫辛酸二氫硫辛酸（非結(jié)合的）在肝臟、腎臟、心臟和皮膚的含量。只有那些用添加了僅給予-硫辛酸添加的飼料喂養(yǎng)的小鼠在上述組織中顯示檢測出非結(jié)合的-硫辛酸或者二氫-硫辛酸二氫硫辛酸。-硫辛酸總量在心臟最高（3.42±2.20nmol/g濕重），在肝臟最低（0.60±0.33nmol/g）。同檢測-硫辛酸一樣，也檢測了所有組織中二氫-硫辛酸二氫硫辛酸，占總量21%至45%不等。沒有測量組織中-硫辛酸的代謝物沒有測量。這是目前最有力的證據(jù)：-硫辛酸在飲食中添加的-硫辛酸，可在組織中積累，相當(dāng)一部分-硫辛

57、酸轉(zhuǎn)化為二氫-硫辛酸二氫硫辛酸。然而，尚未對-硫辛酸在人體的吸收和還原情況進(jìn)行研究沒有研究；在六位健康志愿者中，內(nèi)源性-硫辛酸的血漿濃度水平在為125ng/ml，二氫-硫辛酸二氫硫辛酸在的濃度為33145ng/ml，66但在補(bǔ)充了-硫辛酸的個(gè)體中，-硫辛酸和二氫-硫辛酸二氫硫辛酸的血漿濃度水平還需要深入的研究。另一個(gè)需要深入研究的領(lǐng)域是，外源性給予的-硫辛酸被代謝為更短鏈的類似物的程度。這些類似物可能擁有不同于-硫辛酸本身的作用。在對給予放射性標(biāo)記-硫辛酸的大鼠中開展的研究中顯示，許多-硫辛酸以改變了的形式排泄，包括氧化產(chǎn)物：bisnorlipoate, tetranorlipoate,和-hydroxybisno