原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略

1、微生物基因工程微生物基因工程 李剛 副教授教學內(nèi)容 一、PCR引物的設(shè)計與實驗操作技巧；二、基因組文庫的建立與篩選；三、定向進化技術(shù)在微生物酶制劑研究中 的應用；四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略； 五、真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略。四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略 原核生物表達系統(tǒng)主要包括： 大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)鏈霉菌表達系統(tǒng)等, 其中應用最廣泛的是大腸桿菌表達系統(tǒng)。原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點 1、細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格 低廉； 2、外源基因表達產(chǎn)物的水平高( 如大腸桿菌中目的蛋白的表達量可超過細菌總蛋白量的

2、80%) ； 3、基因背景和表達特性清楚。大腸桿菌表達系統(tǒng) 自20 世紀70 年代以來, 大腸桿菌一直是基因工程中應用最為廣泛的表達系統(tǒng)。尤其是進入后基因組時代以來, 有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展, 對基因表達的要求更高對基因表達的要求更高, 這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇。大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點： 大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、 可以高效表達不同外源基因產(chǎn)物等特點, 是許多外源基因 表達系統(tǒng)中最好的一種, 是目前研究最深入、發(fā)展也最完善的表達系統(tǒng), 大量的有價值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中獲得了超量表達。 缺點：缺點： 大腸

3、桿菌表達體系與其他表達體系相比, 也具有一些缺 點: 高效表達易形成包涵體。不能進行翻譯后的加工修飾, 如糖基化、磷酸化及?；?。大腸桿菌表達系統(tǒng)的操作流程 大腸桿菌表達系統(tǒng)操作的一般程序如下： 獲得目的基因準備表達載體將目的基因插入表達載體中（測序驗證）轉(zhuǎn)化表達宿主菌誘導靶蛋白的表達表達蛋白的分析擴增、純化、進一步檢測。大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念 首先講述一些大腸桿菌表達的基本概念：一個完一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株株，如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實

4、驗目的來考慮擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。 表達載體表達載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動子啟動子，多克隆位點多克隆位點，終止密碼終止密碼，融合融合TagTag（如果有的話），復制子，篩選標記篩選標記/ /報告基因報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的

5、。大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念復制子：復制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復制子的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達量是非通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān)線性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要如果碰巧需要2 2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復制元是否個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復制元是否相容的問題。相容的問題。篩選標記和報告基因：篩選標記和報告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標記氨芐青霉素抗性是最

6、常見的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意在表達篩選中要注意的問題應該就是的問題應該就是LBLB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導致抗生素倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導致抗生素失效。失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？大家大家“隨便倒掉隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在1

7、00多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念 對于做表達來說，如果不是要研究啟動子的強弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半半乳糖苷酶乳糖苷酶，熒光素酶熒光素酶等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點：啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導調(diào)控型表達。laclac和和TacTac，PLPL和和

8、PRPR，T7T7是最常用的啟動子。是最常用的啟動子。 轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用用控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是Rho因子作用下使mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。常見的是常見的是rrnB 、rRNA操縱子的操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。串連轉(zhuǎn)錄終止子。大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本概念 核糖體結(jié)合位點：啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基

9、序列，其中能與其中能與rRNA16S亞基亞基3端互補的端互補的SD序列對形成翻序列對形成翻譯起始復合物是必需的譯起始復合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式 組成型表達：組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。 誘導調(diào)控型

10、表達：誘導調(diào)控型表達：表達載體采用誘導型啟動子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導表達的，也屬于誘導表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)的幾種表達方式融合表達融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（Tag），），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分表達產(chǎn)物為融合蛋白（

11、有分N端或者端或者C端融合表達），方便后繼的純化端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的是最廣泛采用的Tag。分泌表達：分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包涵體，而且表達產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復性?；蛘咝纬砂w，而且表達產(chǎn)物通常

12、是可溶的活性狀態(tài)，不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間周質(zhì)空間。 可溶性表達可溶性表達：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒，包涵體容易純化但是復性效率不包涵體容易純化但是復性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)有助于提高產(chǎn)物的可溶性物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新

13、生 肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如Takara的Chaperone plasmid Set）；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合 成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （8）誘導過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 最早應用于大腸桿菌

14、表達系統(tǒng)的是最早應用于大腸桿菌表達系統(tǒng)的是Lac乳糖操縱乳糖操縱子子，由 啟動子Plac、操縱基因lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。 lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO 上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 tac啟動子啟動子是trp啟動子和lacUV5

15、的拼接雜合啟動子，且轉(zhuǎn)錄水平更高轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。 trc啟動子啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白阻遏蛋白調(diào)控的強啟動子特性。調(diào)控的強啟動子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的lac操縱子，無法應付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達，能過量表達能過量表達lacI阻遏蛋白的阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌表達系統(tǒng)的表達菌株株。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個

16、常用的啟動子 現(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq 基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導表達系統(tǒng)，但是廣泛用于誘導表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導物的研作為誘導物的研究。另外一種研究方向是用究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變的溫度敏感突變體，體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開啟轉(zhuǎn)錄。度開啟轉(zhuǎn)錄。熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導

17、效果，而且熱誘熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 以以噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子噬菌體載體轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR 構(gòu)建的載體也構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于噬菌體噬菌體cI基因產(chǎn)物。基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR 表達載體需要攜帶表達載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達載體，現(xiàn)在更常

18、見的做法菌株作為表達載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴謹調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的的PL表達系統(tǒng)，就是將受表達系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴啟動子嚴謹調(diào)控的謹調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導抑制加入酪氨酸誘導抑制trp啟動子，抑制啟動子，抑制cI基因的表基因的表達，從而解除強大的達，從而解除強大的PL啟動子的抑制。啟動子的抑制。 大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾個常用的啟動子T7啟動

19、子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達的首選，尤其以的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的高活性的T7 RNA 聚合酶合成聚合酶合成mRNA的速度比大腸的速度比大腸桿菌桿菌RNA聚合酶快聚合酶快5倍倍當二者同時存在時，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時目

20、的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要將外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導條件控制控制誘導條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。常用的

21、幾種大腸桿菌表達系統(tǒng) 1、GE（原安瑪西亞）-pGEX系列，特點：使用該系列載體可以很方便進行下一步重組蛋白的純化。 GE（原安瑪西亞）-pGEX系列Invitrogen- Champion pET Expression System等四個系列 比起其它公司的原核表達系列來說Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。像之前Novagen大部分載體都是用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，但是Invitrogen的表達系統(tǒng)大量運用了它的TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)。 Invitrogen公司總共有四個原核表達系統(tǒng)公司總共有四個原核表達系統(tǒng)它們分別是：Champion pET E

22、xpression System、HisPatch ThioFusion System、pBAD Inducible Bacterial System、pL System和T7-based Systems。這四個系列的載體可謂把原核表達的發(fā)展史中出現(xiàn)過的幾種啟動子都囊括進去了，包括T7、pL、pBAD和trc啟動子，同時幾種經(jīng)典的調(diào)控方式也都出現(xiàn)了，包括有乳糖操縱子、色氨酸操縱子和阿拉伯糖操縱子。 Champion pET Expression System之所以取了個冠軍系統(tǒng)的稱號是因為它結(jié)合了經(jīng)典的T7表達系統(tǒng)和Invitrogen的王牌定向TOPO技術(shù)及Gateway技術(shù)，這可謂是強強聯(lián)

23、手。 Invitrogen pET100/D-TOPO載體圖譜載體圖譜Novagen公司-pET表達載體序列 Novagen公司公司（Merck的子公司）出品了多種原核表達載體系列，其中的pET系列載體系列載體是目前應用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)是目前應用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的異源蛋白。pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行表達的載體。Novagen公司的pET表達載體系列pET Vectors with unique features include:pET-31b(+) for high yield bioproduction of pept

24、ides and small proteins pET-32a-c for production of soluble, active target proteins in E. coli pET-33b for production of target proteins suitable for site-specific 32P-labeling pET-39b and 40b using Dsb tags for export and periplasmic folding of target proteins pET-41a-c and 42a-c with popular GST f

25、usion tags for enhanced production and solubility pET-43.1a-c designed for cloning and high-level expression of polypeptide sequences fused with the 495 aa NusA (NusTag) protein pET-44a-c with NusTag sequence plus N- and C-terminal HisTag sequences pET-45b(+) with amino-terminal HisTag sequence and

26、minimal extraneous sequences pET-46 Ek/LIC prepared vector for ligation-independent cloning, with amino-terminal HisTag sequence pET-47b(+) through pET-50b(+) with HRV 3C Protease cleavage site for efficient fusion tag removal Additional vectors in this table include:pLacI pLysE and pLysS Novagen公司的

27、公司的PET32a表達載體圖譜表達載體圖譜Novagen公司的pET表達載體選擇從開始涉及表達的時候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進行選擇，Novagen公司僅提供三個載體：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。根據(jù)是否要可溶性表達，選擇加有不同標記的載體。一般說來在大腸桿菌中不加標記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達。為了讓外源蛋白融合表達一般說來有三個策略：1. 與一個高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達，比如：谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione Stransferase, GST）、硫氧還蛋白（thioredoxi

28、n, Trx）和N利用底物A蛋白（N utilization substance A, NusA）。2. 轉(zhuǎn)入一個酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白，DsbA，DsbC。3. 插入一個定位到周質(zhì)空間的信號肽序列。以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍白斑篩選可以使用pETBlue系列載體。在重組技術(shù)上，在重組技術(shù)上，Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式隆方式：Ligation-Independent cloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的

29、片斷互補。在設(shè)計PCR擴增引物時加入與LIC載體互補的序列，PCR產(chǎn)物用35的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇Novagen提供多種表達使用的菌株，為了提高表達量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個種類：1. 蛋白酶缺陷型，這包括有B834, BL21, BLR,Origami B, Rosetta和Tuner。因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。BL21(DE3)是應用最多的表達的表是應用最多的表達的表達菌株達菌株。另外它的衍生株另外它的衍生株BLR(DE3)是是recA，RecA是大腸桿菌中

30、是大腸桿菌中介導同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。介導同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。2. 保證所有細胞以同樣量進行表達Tuner株及它的衍生株（Origami B和和Rosetta）是BL21菌株的lacY1缺失突變型，在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細胞中表達。胞中表達。Lac滲透酶的突變使進入每個細胞的IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對通過對IPTG濃度的濃度的控制可以使細胞微量表達或者大量表達?？刂瓶梢允辜毎⒘勘磉_或者大量表達。一般說來，低濃度表達有利于蛋白

31、的可溶性和活性。Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇3. 二硫鍵形成與溶解性增強二硫鍵的形成對某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB， Origami，Origami B和和Rosetta-gami。在這些菌株中表達蛋白，可以更大程度促進二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形可以更大程度促進二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。4. 稀有密碼子的補給不同物種有不同的密碼子偏愛性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，

32、特別當這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達量極低，或者翻譯提前終止。Rosetta是為了表達真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有是為了表達真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子大腸桿菌稀有的密碼子tRNA，包括，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和和GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。5. 硒蛋氨酸標記B834是來源于是來源于BL21的蛋氨酸（的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標記和晶體成像

33、蛋氨酸標記中非常有用。標記和晶體成像蛋氨酸標記中非常有用。原核表達需要考慮的問題 在原核蛋白表達過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達體系需要綜合考慮3大因素：表表達載體、宿主菌株、表達誘導條件達載體、宿主菌株、表達誘導條件,以獲得最滿意的表達效果。大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效表達策略 1、采用高強度啟動子-如T7啟動子； 2、將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌 偏好的密碼子（需要重新合成基因）， 或采用含有大腸桿菌稀有密碼子tRNA 的Rosetta系列菌株。 3、采用豐富培養(yǎng)基（如TB）代替普通的LB培養(yǎng) 基； 4、優(yōu)化大腸桿菌的生長條件和目的基因的誘導表 達條件。使用pET表達系統(tǒng)的常見問題分析 幾

34、個常見問題如下表：原核表達常見的幾個問題及回答（1） 1、目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。 解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。提高大腸桿菌表達系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略大致有八種策略：（1）在細胞中表達分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免 肽鏈相互聚合；（2）共表達折疊酶，催化共價鍵形成；（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度；（4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合 成速度；（5）選擇適合的宿主菌株；（6）表達含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，

35、因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （8）誘導過程中加入化學物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。原核表達常見的幾個問題及回答（2） 2、必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？ 回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有His- Tag,S-Tag,11個氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽時仍能表現(xiàn)出完全的活性。這些肽段都較為親水，理論上都不會干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導序列才能適合特定的應用要求。原核表達常見的幾個問題及回答（3） 3、如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目

36、的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？ 回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB這樣的前導序列，理論上它應該被運至細胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因為細胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。除了信號肽對蛋白質(zhì)的運輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)也有影響。因此在細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。某些情況下降低誘導時的培養(yǎng)溫度至25-30 ，可能提高蛋白運輸?shù)谋壤Ｔ吮磉_常見的幾個問題及回答（4） 4、IPTG誘導后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了？ 回答：T7RNA聚合酶非?；钴S，T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統(tǒng)的性能。但也有一些例外情況，例如特別的目的但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴緊的載體基因以及一些極為嚴緊的載體/宿主菌組合宿主菌組合(比如比如含有含有plysE的宿主菌的宿主菌)等，這時在誘導后菌落還是等，這時在誘導后菌落還是會繼續(xù)生長。會繼續(xù)生長。原核表達常見的幾個問題及回答（5）5、除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達水平？回答：（1）mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾