液相培訓(xùn)內(nèi)容

1、L600系列液相色譜儀培訓(xùn)內(nèi)容一、 基本原理色譜技術(shù)是利用待測組分與流動相、固定相之間的作用（分配系數(shù)）不同，從而實現(xiàn)分離的過程。先解釋2個名詞：1、 流動相：顧名思義是在整個系統(tǒng)中處于流動狀態(tài)的流體。流動相是液體的叫液相（就是我們今天要學(xué)習(xí)的這一款儀器），起到運(yùn)輸樣品和參與組分分離的作用。流動相是氣體的叫氣相，只起運(yùn)輸樣品的作用。2、 固定相：是靜止不動的一相，裝填或涂布于色譜柱內(nèi)，參與組分分離。 “分離”是色譜區(qū)別于光譜儀器最大的特點和作用，一般的光譜儀器只能通過波長等特性從混合物中去選擇待測物，一般一次只能檢測一種物質(zhì)；而色譜能夠?qū)?fù)雜的混合物逐一分離成單一組分，逐個檢測，可以實現(xiàn)多種組

2、分的同時分析，比如我們熟悉的色素，蘇丹紅1、2、3、4，就可以一針進(jìn)樣同時檢測。二、 儀器結(jié)構(gòu)及各部分的使用要點液相色譜一般由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)構(gòu)成。下面我們按照這個組成的順序逐一講解每一部分的使用要點。1、 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)顧名思義就是用來輸送流動相的部分，它包含了“輸”和“液”兩部分，“輸”的部分就是指高壓輸液泵，它就像我們?nèi)梭w的心臟一樣，是一切動力的源頭，沒有它液體不可能流動?！耙骸本褪侵噶鲃酉嗔?，它就像我們?nèi)梭w的血液一樣，在泵給與的動力下，運(yùn)送到整個系統(tǒng)。下面分別講解這兩部分的使用方法和注意事項。（1） 流動相a、 流動相類型：我們一般使用的流動相有三

3、種類型，第一種是純的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等，其中甲醇是最常用的，通常用它來沖洗平衡系統(tǒng)，C18柱在工作完后需要保存在純甲醇中。第二種是檢測樣品用的流動相，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)或方法來配置，通常含有緩沖鹽。第三種是10%-20%的甲醇水溶液（比例并不需要非常的準(zhǔn)確），它是用于純有機(jī)溶劑與含有緩沖鹽的流動相之間的過渡沖洗液，因為緩沖鹽溶于水但不溶于有機(jī)溶劑，如果不過渡直接更換，就會使緩沖鹽在有機(jī)溶劑中析出成結(jié)晶鹽，造成系統(tǒng)的堵塞，尤其是色譜柱，這是不可逆的損壞。但也不能直接用純水來做過渡液，這是因為水的表面張力很大，直接用純水來沖洗，容易造成色譜柱碳鏈的斷裂，就是我們常說的“疏水坍塌”，因此需要在

4、水里面加入一定比例的有機(jī)溶劑減少其表面張力，使沖洗過程變得柔和，保護(hù)碳鏈。b、 流動相容器：我們平時需要在液相色譜的頂端流動相盒中至少準(zhǔn)備三個瓶子來分別裝盛以上三種液體。當(dāng)然，如果你的儀器是梯度配置，你可以準(zhǔn)備一個裝純水的容器，讓儀器自己去將甲醇和水混合形成過渡沖洗液。裝盛流動相的容器必須是玻璃或耐腐蝕的聚四氟乙烯材質(zhì)，視流動相的性質(zhì)，需要避光的就裝在棕色瓶中。絕對不允許裝在塑料瓶中，因為有機(jī)溶劑會溶解塑料制品，雜質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)會造成堵塞及鬼峰增多，既損壞儀器，又影響分析。容器要盡量蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。容器應(yīng)定期清洗或更換，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的

5、微生物。c、 流動相處理三要素：第一是必須選擇高純試劑，有機(jī)溶劑必須是色譜純級以上的，一般瓶身上都有HPLC標(biāo)志，盡量選擇較好的品牌，因為即使都是色譜純的試劑，國產(chǎn)和進(jìn)口的，不同廠家的品質(zhì)也有差別。水必須是超純水，所以實驗室最好備有超純水器，如果沒有超純水器，也至少要購買正品娃哈哈或屈臣氏的純凈水，一般的蒸餾水甚至是重蒸水，都達(dá)不到液相分析的要求，如果勉強(qiáng)使用，短期內(nèi)不是不可以，但肯定會造成色譜柱使用壽命的縮短，也會在一定程度上影響基線噪聲。第二是過濾，盡管我們選擇了高純的試劑，但剛才也說到不同品牌的試劑是有差異的，為了更為保險，上機(jī)前，我們都要將流動相使用液相專用的溶劑過濾器進(jìn)行過濾操作。過

6、濾要注意濾膜的選擇，一般采用0.45um的微孔濾膜，濾膜有有機(jī)系和水系之分，要注意根據(jù)流動相的種類進(jìn)行選擇，千萬不要選錯，尤其是不要用水系濾膜去過濾有機(jī)溶劑和含有有機(jī)溶劑的流動相，原則就是凡是過濾含有有機(jī)溶劑的試劑，無論比例多少，我們都采用有機(jī)系濾膜，不含的則選用水系濾膜。第三是脫氣，我們一般采用超聲脫氣20分鐘，操作比較簡單實用，如果是多種液體混合的，一定是混合后再脫氣，千萬不要分別脫氣了再混合，否則混合之前的脫氣工作就白做了，一混合又有氣泡了。d、 流動相使用的時間：試劑最好都是臨用現(xiàn)制的。在實驗前計算好一天的使用量。如果有剩余的話，不同的流動相采用不同的做法。純的有機(jī)溶劑剩余，就用蓋子密

7、封嚴(yán)實，第二天可以接著使用，如果放置了一段時間的有機(jī)溶劑，就再經(jīng)過一次過濾和超聲處理再使用。放置時間太久的試劑建議就不要使用了。含水流動相（不含緩沖鹽），三天內(nèi)可以使用。三天后建議不再使用，重新配置。含有緩沖鹽的流動相，必須現(xiàn)用現(xiàn)配，最好當(dāng)天使用完，如果實在配制太多，頂多不能使用超過兩天。（2） 高壓輸液泵：泵頭部分我們需要操作的地方主要有兩個，一是排空閥，每當(dāng)更換流動相，或發(fā)現(xiàn)管路里有氣泡時，都需要打開排空閥進(jìn)行排空操作。排空一般用3-5ml/min的流速，運(yùn)行3-5min，具體流速和時間視氣泡多少而定。二是泵頭在線密封清洗，它的作用是減少泵頭緩沖結(jié)晶鹽析出的機(jī)率。如果您的流動相是含有緩沖鹽

8、的，就在每天實驗結(jié)束后，利用沖洗系統(tǒng)和色譜柱的這段時間進(jìn)行泵頭的清洗，將清洗管進(jìn)液端插入10%-20%甲醇水溶液中，用吸耳球從排廢管末端將液體吸出，管路會依靠重力的作用持續(xù)流動清洗，大約沖洗20-30min即可。檢漏：從泵到色譜柱之前都是處于高壓的部分，在高壓的狀態(tài)下，如果螺釘沒有擰緊就會有漏液的情況，所以我們要不時地查漏。查漏的方法是用定性濾紙邊緣對準(zhǔn)每一個螺母接頭等地方試探，看有沒有液體浸潤濾紙，如果有漏的話，濾紙很容易就潤濕了，很容易觀察到。2、 進(jìn)樣系統(tǒng)我們通常用的進(jìn)樣裝置是六通進(jìn)樣閥，它的閥位有兩檔，load是準(zhǔn)備階段，用于我們將樣品注入定量環(huán)，inject是進(jìn)樣階段，讓流動相將樣品

9、帶入色譜柱。關(guān)于進(jìn)樣我們要注意以下幾點：（1） 新的六通閥進(jìn)樣器最好用甲醇和色譜用純水清洗，以保證不會帶入雜質(zhì)。（2） 樣品要經(jīng)過0.45um的針式過濾器過濾后才能打入系統(tǒng)，針式過濾器也有水系和有機(jī)系之分，選擇的原則同樣是看溶解樣品的溶劑是否含有有機(jī)溶劑，如果含有則用有機(jī)系，反之則用水系。（3） 我們使用的進(jìn)樣針是液相專用的平頭進(jìn)樣針，千萬不要用成氣相用的尖頭進(jìn)樣針，否則會損壞六通閥。（4） 為了使樣品能夠充分的充滿定量環(huán)，我們的取樣量應(yīng)該是定量環(huán)體積的三倍以上，例如我們的定量環(huán)是20uL時，我們至少應(yīng)該吸入60uL以上的樣品打入，多余的樣品會從廢液管流出。（5） 進(jìn)樣針吸取樣品時很容易吸入氣

10、泡，要像護(hù)士打針一樣將針管中的氣泡排出，然后用濾紙將針頭上殘留的液體輕輕吸干，才能打入定量環(huán)，注樣前務(wù)必檢查六通閥是否處于load狀態(tài)。（6） 注樣時針頭一定要稍用力插到底。（7） 掰閥時一定要迅速，中間更不能停留。（8） 掰閥至inject進(jìn)樣后，不必將進(jìn)樣針立即拔出，也不必將閥立即掰回到load狀態(tài)，可以讓它維持至這一針分析即將結(jié)束，準(zhǔn)備進(jìn)下一針之前再將閥掰回并取出進(jìn)樣針。在這個過程中，流動相可以同時清洗定量環(huán)。（9） 每天工作結(jié)束后，要充分清洗進(jìn)樣閥，可以利用附件箱中白色大針筒，吸取一定量的清洗液，套上六通閥自帶的白色平頭針頭，在load狀態(tài)下，緩慢注入定量環(huán)來進(jìn)行清洗。清洗液一般可以用

11、甲醇、異丙醇等有一定洗脫強(qiáng)度的有機(jī)溶劑，如果樣品的溶劑也是含有緩沖鹽的，那么也請先用10%-20%的甲醇水溶液過渡性清洗后，再用純的有機(jī)溶劑清洗，同樣也是為了減少結(jié)晶鹽的析出。（10） 每天工作結(jié)束后，要充分清洗進(jìn)樣針，清洗液的選擇同上（9）。清洗完畢后保存到針盒中，避免跌落損壞。3、 分離系統(tǒng) 液相色譜的分離系統(tǒng)主要就是指的色譜柱，在這里我們主要針對常用的C8、C18反相色譜柱，如果您使用的是正相色譜柱，使用和維護(hù)請參照具體的使用說明。反相色譜柱的維護(hù)注意以下幾點：（1） 色譜柱的安裝是有方向性的，請按照色譜柱身上的箭頭指示方向安裝，切勿裝反了。否則容易損壞色譜柱。（2） 每天開機(jī)要充分平衡

12、色譜柱，如果測樣流動相是含有緩沖鹽的，請先用10%-20%的甲醇水溶液沖洗30分鐘以上，再用測樣流動相平衡至基線平穩(wěn)即可做樣。如果測樣流動相不含緩沖鹽，則可以直接用測樣流動相平衡至基線平穩(wěn)即可做樣。（3） 每天實驗結(jié)束后要充分清洗色譜柱，如果測樣流動相是含有緩沖鹽的，請先用10%-20%的甲醇水溶液沖洗30分鐘以上，再用純甲醇沖洗30分鐘以上才能關(guān)機(jī)。如果測樣流動相不含緩沖鹽，則可以直接用純甲醇沖洗30分鐘以上即可關(guān)機(jī)。（按照我們通常使用的1ml/min的流速，一般色譜柱需要20-30分鐘才能置換掉之前的溶液，因此每換一種流動相時都需要走至少30分鐘以上）。（4） 長時間不用時，請將色譜柱在充

13、滿甲醇的狀態(tài)下拆下，兩端用堵頭封好，裝入色譜柱盒內(nèi)保存，避免跌落損壞。同時將儀器上連接色譜柱兩端的不銹鋼管接頭用保鮮膜封好即可。（5） 再次安裝色譜柱時，請先運(yùn)行泵，使液體充分流經(jīng)柱前端的管路，待有液體流出后，再裝上色譜柱，避免空氣擠入柱內(nèi)。4、 檢測系統(tǒng)檢測器我們基本沒有需要操作的地方，但要注意實驗室的濕度環(huán)境，太潮濕的環(huán)境，檢測器中的光學(xué)部件容易發(fā)霉，造成使用異常。5、 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)主要是指我們的色譜工作站，工作站本身沒有需要維護(hù)的地方，在這里詳細(xì)描述具體的使用方法。² 開機(jī)前請確保溶劑瓶中已裝好流動相，并且都經(jīng)過了過濾和超聲脫氣處理，進(jìn)液管已插入溶劑瓶中位于液面以下

14、。在運(yùn)行的過程中要時刻注意流動相的用量，不夠時及時添加。（1）啟動：開機(jī)，將您所要使用的儀器的電源全部打開，然后鼠標(biāo)雙擊電腦桌面上的液相軟件圖標(biāo)，打開色譜工作站。進(jìn)入用戶管理登陸界面（如圖1），默認(rèn)的用戶名是“admin”，密碼是“000”。您還可以通過“用戶管理”程序重新設(shè)置用戶及權(quán)限圖1 登陸界面進(jìn)入液相色譜工作站主界面后，可以看到8個功能模塊（如圖2）。其中我們?nèi)粘Ｗ畛Ｓ玫氖恰翱刂撇杉焙汀皵?shù)據(jù)分析”，用于儀器的控制、色譜圖的采集、色譜圖的分析及報告的打印。偶爾會用到“報告編輯”和“用戶管理”，用于報告模板的編輯及用戶權(quán)限的設(shè)置。其他模塊，基本用不到。圖2 工作站主界面（2）打開“控制采

15、集”界面：單擊“控制采集”按鈕，按鈕變藍(lán)，然后單擊界面右下角的“啟動”按鈕，出現(xiàn)“儀器自檢”界面（如圖3）。圖3 儀器自檢 儀器自檢全部通過并經(jīng)過參數(shù)的初始化后，直接進(jìn)入到“控制采集”界面（如圖4）。圖4 控制采集界面（3）排空：手動旋開泵的排空閥，將鼠標(biāo)放在flash圖表示泵的部分并單擊鼠標(biāo)右鍵，選擇“沖洗”，彈出沖洗控制對話框（如圖5），設(shè)定“沖洗流速”和“沖洗時間”（排空一般用3-5ml/min的流速，運(yùn)行3-5min，具體流速和時間視氣泡多少而定），單擊確定。到達(dá)設(shè)定的時間，此操作將會自動停止，停止后手動擰緊泵的排空閥。當(dāng)然您也可以使用系統(tǒng)默認(rèn)的流速和時間，當(dāng)判定氣泡已經(jīng)充分排出后，手

16、動停止沖洗，隨即擰緊排空閥。圖5 泵沖洗控制對話框（4）設(shè)置參數(shù)：在“控制采集”界面將鼠標(biāo)放在flash圖的任意部分并單擊右鍵，在右鍵菜單中單擊任意“設(shè)置”項，隨即彈出儀器參數(shù)設(shè)置的頁簽表，按照測樣方法的要求設(shè)置儀器參數(shù)。主要設(shè)置的內(nèi)容包括：a、 檢測器中的檢測波長圖6 檢測波長的設(shè)置b、 檢測器中的運(yùn)行時間：這個時間必須大于您所測樣品全部目標(biāo)峰出峰的時間，否則峰還沒有出完，儀器就自動采集了。圖7 檢測波長的設(shè)置c、 檢測器中的時間梯度表格：一般不常用，但有時候會用到，例如同時分析蘇丹紅I、II、III、IV的時候，蘇丹紅的檢測波長是478nm ；蘇丹紅、的檢測波長是520nm，就需要啟用波長

17、的時間梯度功能，在蘇丹紅出峰后切換波長。假設(shè)蘇丹紅是在6分鐘時出峰，蘇丹紅、分別是在10、12、15分鐘出峰的，那么我的時間梯度可以設(shè)置為圖8中的參數(shù)。該參數(shù)的意義是從0-7分鐘，波長保持在478nm（涵蓋了蘇丹紅出峰的時間），從7-8分鐘，波長從478nm切換到520nm，從8-16分鐘，波長保持在520nm（涵蓋了蘇丹紅、出峰的時間），最后用1分鐘，切換回初始波長478nm。圖8 波長時間表格的設(shè)置 如果您需要用到時間梯度功能，請在“啟用時間表格”前打上勾，當(dāng)掰動六通閥至inject狀態(tài)時，儀器就會按照這個時間表運(yùn)行；如果您不需要用到該功能，就不要打勾，掰閥后，儀器就會按照常規(guī)設(shè)置中的檢測

18、波長運(yùn)行。d、 泵的流速圖9 總流速的設(shè)置e、 泵的流動相比例：當(dāng)您的儀器是等度配置時，這一項不用設(shè)置，始終是100%；當(dāng)您的儀器是梯度配置時，需要根據(jù)您的流動相配比在如圖10的位置，分別設(shè)定A泵和B泵的流動相比例。圖10 流動相比例的設(shè)置 f、 泵的梯度洗脫參數(shù)：如果您的儀器是等度配置，這里不用設(shè)置。如果您的儀器是梯度配置，您可以在如圖11的位置設(shè)定您的梯度程序。圖中參數(shù)的意義是從0-1分鐘，A泵流動相的比例從25%逐漸變至15%，B泵流動相的比例從75%逐漸變至85%；從1-2分鐘，A泵流動相的比例從15%逐漸變至0%，B泵流動相的比例從85%逐漸變至100%。一般最后要將流動相比例變回0

19、分鐘時的初始流動相比例，下圖雖沒有體現(xiàn)，但要注意這一點。本人因為是在脫機(jī)狀態(tài)下，沒辦法進(jìn)行設(shè)置圖11 流動相比例的設(shè)置 如果您需要用到梯度洗脫功能，請在“啟用梯度表格”前打上勾，當(dāng)掰動六通閥至inject狀態(tài)時，儀器就會按照這個梯度表運(yùn)行；如果您不需要用到該功能，就不要打勾，掰閥后，儀器就會按照常規(guī)設(shè)置中的流動相組成來運(yùn)行。 其他未提及的參數(shù)，均不用理會。設(shè)置完成后，單擊對話框下面的“設(shè)置”按鈕，所做的設(shè)置即可生效。如果想要將該設(shè)置保存，可以在“方法”菜單中選擇“方法另存為”選項，將方法保存起來。如果已有可供使用的方法，可以在“方法”菜單中選擇“載入方法”，即可將方法載入。（如圖12）圖12

20、方法的保存與載入（5）平衡系統(tǒng)：參數(shù)設(shè)置完成后，可以直接點擊，使泵開啟，然后點擊，使圖譜開始采集。每一種流動相的平衡通常需要半小時左右，您可以觀察基線是否走平來判斷系統(tǒng)是否達(dá)到平衡。 根據(jù)色譜柱和流動相的的不同分幾種情況：a、 如果您使用的是新色譜柱或是很長時間沒有用過的色譜柱，請先用純甲醇走系統(tǒng)至少30min。然后看您測樣的流動相是否含有緩沖鹽，如果含有緩沖鹽，請在走完甲醇后用10%-20%的甲醇水溶液走系統(tǒng)至少30min，最后換成測樣流動相，在測試方法要求的條件下充分平衡至基線平穩(wěn)；如果不含緩沖鹽，走完甲醇后可以直接用測樣流動相在測試方法要求的條件下充分平衡至基線平穩(wěn)。b、 如果您用的是一

21、直在使用的色譜柱，開機(jī)可以不走甲醇。直接看您測樣的流動相是否含有緩沖鹽，如果含有緩沖鹽，開機(jī)后先用10%-20%的甲醇水溶液走系統(tǒng)至少30min，然后換成測樣流動相，在測試方法要求的條件下充分平衡至基線平穩(wěn)；如果不含緩沖鹽，開機(jī)可以直接用測樣流動相在測試方法要求的條件下充分平衡至基線平穩(wěn)。（6）進(jìn)樣：觀察到基線平穩(wěn)后，您此時可以進(jìn)樣了。進(jìn)樣的方法和細(xì)節(jié)請參見前面進(jìn)樣系統(tǒng)的講解。（7）保存數(shù)據(jù)：當(dāng)目標(biāo)組分的色譜峰全部出完后，您可以選擇手動點擊采集按鈕停止采集，或等待設(shè)定的運(yùn)行時間到達(dá)后自動結(jié)束采集。然后通過“文件”菜單另存為“色譜數(shù)據(jù)”（如圖13）將色譜圖保存在您想要保存的位置。如果您忘記將數(shù)據(jù)

22、另存，也沒有關(guān)系，所有的原始數(shù)據(jù)在C盤下的LC1.0或LC2.0的文件夾里都能找到。圖13 色譜數(shù)據(jù)的保存（8）打開“數(shù)據(jù)分析”界面：您可以通過在主界面選擇數(shù)據(jù)分析界面，并單擊“啟動”按鈕來打開分析界面。圖14 數(shù)據(jù)分析界面的啟動進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的基本步驟如下：a、 打開數(shù)據(jù)：單擊快捷菜單欄中的按鈕來打開色譜數(shù)據(jù)。也可以通過“文件”菜單的“打開數(shù)據(jù)”來完成。您可以選擇打開一個或同時打開多個數(shù)據(jù)。b、 積分：Ø 單擊快捷菜單欄中的按鈕進(jìn)入積分界面。圖14 積分界面Ø 單擊快捷菜單欄中的按鈕調(diào)出積分事件表，或通過“積分”菜單的“積分事件表”來打開。圖14 積分事件表界面每次打開數(shù)據(jù)

23、文件時都會根據(jù)當(dāng)前數(shù)據(jù)處理方法自動進(jìn)行積分處理。如果您對當(dāng)前方法的處理結(jié)果不滿意，可以通過積分事件表修改相應(yīng)的積分參數(shù)。 通過點擊積分事件界面右側(cè)的按鈕（倒數(shù)第二個），在色譜圖上選擇起點和終點，可以將這段區(qū)域的所有峰積分取消。通過點擊積分事件界面右側(cè)的按鈕（倒數(shù)第一個），在色譜圖上選擇目標(biāo)峰的起始點和終點，可以對該組分峰手動積分。如果您對任何一步積分行為不滿意，可以通過如圖15的“刪除行”來刪除你的某一步積分操作。最后處理到積分結(jié)果表中只剩下我們的目標(biāo)組分是最理想的。圖15 積分事件表界面的刪除行c、 校正：Ø 單擊快捷菜單欄中的按鈕進(jìn)入校正界面。在校正界面我們可以完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和未知樣品的定量分析。Ø 做標(biāo)準(zhǔn)曲線：打開所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，在積分界面分別對它們進(jìn)行積分之后，即可進(jìn)入校正界面開始做標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先選中最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，點擊快捷菜單欄中的按鈕“新建校正任務(wù)”，彈出如圖16（A）的對話框，在化合物含量里輸入您配置的該標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，點確定，即生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的一個點。然后選中第二個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，點擊