層黏連蛋白α1、α2、α3、α5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

1、層黏連蛋白1、2、3、5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)【摘要】 目的 探討層黏連蛋白（laminin，LN）1，2，3，5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特征。 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法和圖像分析技術(shù)分析77例腦膠質(zhì)瘤、8例正常腦組織以及10例腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中LN1、2、3、5亞基的表達(dá)情況。 結(jié)果 （1）人腦膠質(zhì)瘤中，LN2，3呈陰性，LN1，5陽性染色位于瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，其陽性染色強度與病理級別密切相關(guān)（P<0.01）；（2）LN5在血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜呈陽性染色，染色強度與病理級別比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但明顯強于腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤（P<0.05），后者

2、常表現(xiàn)為基膜不連續(xù)弱陽性染色。 結(jié)論 （1）LN1，5亞基的表達(dá)強度與腦膠質(zhì)瘤病理級別密切相關(guān)；（2）LN5在腦膠質(zhì)瘤和腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜表達(dá)的差異可能與瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 腦腫瘤 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 腫瘤轉(zhuǎn)移 層粘連蛋白 免疫組織化學(xué) ABSTRACT: Objective To explore expression patterns of laminin 1、2、3、5 subunit in the human brain glioma. Methods The expression of laminin 1、2、3、5 subunit in 77 brain gli

3、oma,8 normal brain tissue and 10 metastatic tumor specimens were analyzed by immunohistochemistry and image analysis technique. Results 1.There were negative expression of laminin 2 / 172、3 subunit and positive expression of laminin 1、5 subunit in the human brain gliomas, whose positive staining loc

4、ated in tumour cell membrane, plasma. The positive staining intensity was correlated with pathological grade of glioma（P<0.001）. 2.There were also positive expression of laminin 5 subunit in blood vessel endothelial cells and basal membrane, which intensity was not correlated with pathologica

5、l grade of glioma (P>0.05), but was stronger than expression in metastatic tumor (P<0.05). Conclusion 1.The expression intensity of laminin 1、5 subunit in tumor cells was closely correlated with pathological grade of glioma. 2.The expression difference of laminin 5 subunit in brain gli

6、oma and metastatic tumor was probably correlated with the metabasis behavior of tumor cells. KEY WORDS: brain neoplasms; glioma; neoplasm metastasis; laminin; immunohistochemistry福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2008年7月 第42卷第4期梅文忠等：層黏連蛋白1、2、3、5亞基在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)層黏連蛋白（laminin，LN）是一族具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)糖蛋白，它們參

7、與基底膜構(gòu)建，對維持基底膜的完整結(jié)構(gòu)起重要作用，還在細(xì)胞黏附、生長、遷移中扮演著至關(guān)重要的角色1。研究表明，某些LN分子在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，且與腫瘤病理級別相關(guān)，參與膠質(zhì)瘤侵襲性生長而罕見顱外轉(zhuǎn)移行為的調(diào)控23,但是以往的研究多是針對LN蛋白分子或某些LN亞型分子的研究，如LN5，LN8，LN9，LN10/11等。本實驗采用免疫組織化學(xué)SP法檢測LN1，2，3，5亞基在不同病理級別的腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，探討其與人腦膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的關(guān)系。1 材料和方法1.1 材料手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本77例，其中星形細(xì)胞瘤41例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例、混合型膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例、室管膜瘤9例

8、、髓母細(xì)胞瘤3例、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤7例。77例中，男性49例、女性28例，年齡（35±5.9）歲（370歲）。參照2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類及分級標(biāo)準(zhǔn)：級10例，級34例，級23例，級10例；術(shù)前均未接受放療或化療。取10例經(jīng)病理檢查證實的非神經(jīng)系統(tǒng)來源的腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本，男性7例，女性3例，年齡（54±2.8）歲（4572歲）。8例正常腦組織標(biāo)本取自顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)患者，男性5例、女性3例，年齡（37±4.3）歲（1361歲）。所有組織標(biāo)本取后立即用10福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，研究時選取典型蠟塊作24 m連續(xù)切片。1.2 方法1.2.1 主要試劑羊抗人LN

9、1，2，3，5亞基多克隆抗體(濃縮型)購自美國SantaCruz公司；超敏SP試劑盒購自福州Maixin Bio公司。1.2.2 免疫組織化學(xué)使用檸檬酸鹽（PH 6.0）高溫高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，免疫組織化學(xué)使用超敏SP法，具體參照說明書進(jìn)行?？贵w工作濃度（1100）。1.2.3 結(jié)果判斷定位于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評分3：著色缺如者為0分、淡者為1分、適中者為2分、深者為3分；著色細(xì)胞占細(xì)胞記數(shù)百分率5%為0分、5%25%為1分、26%50%為2分、50%為3分；每張切片著色與著色百分率得分相乘為其最后得分：規(guī)定01分者為陰性（-）、23分者為弱陽性（

10、+）、46分者為陽性（+）、>6分者為強陽性（+）。 在腦膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及血管基膜染色陽性的指標(biāo)，利用ImagePro Plus 6.0軟件測定陽性染色的血管內(nèi)皮及基膜的平均光密度值（average optical density，AOD）和陽性染色的微血管管壁厚度（microvascular wall thickness，MWT）。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，采用單因素方差分析、Kendalls等級相關(guān)分析檢驗方法。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 LN1，5的表達(dá)LN1主要定位在腫瘤細(xì)胞膜上，病理級別

11、越高染色越強；陽性染色的細(xì)胞呈巢狀分布或散在分布，在少數(shù)高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中還可見陽性染色的瘤細(xì)胞圍繞著血管分布，而在血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜無染色（表12，圖1）。表1 LN1，LN5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá)強度與病理級別的關(guān)系（略）表2 LN5在血管內(nèi)皮及基膜中的陽性表達(dá)強度與腦內(nèi)腫瘤惡性程度的關(guān)系（略） LN5不僅在所有膠質(zhì)瘤的瘤體及瘤周腫瘤細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)上有染色，且病理級別越高染色越強；同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜也出現(xiàn)陽性染色，表現(xiàn)為靠管腔的一層內(nèi)皮細(xì)胞和基膜呈連續(xù)、完整的陽性染色，但染色強度在膠質(zhì)瘤各級別之間無明顯差異。然而，LN5在正常腦組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞及基膜無陽性染色，在腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的血管

12、內(nèi)皮細(xì)胞及基膜也僅見弱陽性染色，但染色基膜呈不連續(xù)，染色強度低于膠質(zhì)瘤組；不過，膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本血管腔中紅細(xì)胞膜上均可見LN5強陽性染色(圖1,2)。2.2 LN2、3的表達(dá)情況 LN2、3亞基在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜中均無陽性表達(dá)。3 討 論 研究發(fā)現(xiàn)，LN能增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞活動性，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞粘附和遷移，促進(jìn)腫瘤的侵襲1,3。陳菊祥等利用含13939種人類基因的BioStarH40S型芯片篩選人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與侵襲性相關(guān)基因的表達(dá)和功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)層黏連蛋白、血小板衍化生長因子受體A（PDGFRA）等8條細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)基因均在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著上調(diào)4。研究也發(fā)現(xiàn)PDGFRA和

13、LN可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲性增強5。最近，Kawataki等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)含3的LN5和含5的LN10可強烈的促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，含1的LN1作用較弱，含2的LN2和4的LN8在體外對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移無促進(jìn)作用6。本研究發(fā)現(xiàn)，LN1、5在膠質(zhì)瘤的瘤體及瘤周、瘤細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜均有表達(dá)，表明LN可由瘤細(xì)胞合成、組裝、分泌；本研究發(fā)現(xiàn)LN1、5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞漿膜的表達(dá)強度與病理級別密切相關(guān)，隨著病理級別的增高而表達(dá)增強，提示它們可能與瘤細(xì)胞惡性程度有關(guān)，促進(jìn)瘤細(xì)胞之間或瘤細(xì)胞與ECM、血管基膜之間的黏附和遷移。 臨床病理發(fā)現(xiàn)，腦組織雖是身體其他器官原發(fā)癌轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位，但顱內(nèi)

14、原發(fā)腫瘤卻很少顱外轉(zhuǎn)移，其原因也被認(rèn)為與LN在腦膠質(zhì)瘤中的分布特征有關(guān)3。本研究發(fā)現(xiàn)，LN5在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜上表達(dá)增高，且LN5在基膜上的表達(dá)是連續(xù)的、完整的，與之前的文獻(xiàn)報道基本相符；而在腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中見LN5在血管內(nèi)皮和基膜的表達(dá)較弱，且不連續(xù)、有斷裂。提示LN5可能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲血管向顱外轉(zhuǎn)移。 基膜上的LN除了可抑制瘤細(xì)胞穿越血管壁而發(fā)生轉(zhuǎn)移外，還可通過與瘤細(xì)胞表面存在LN受體（整合素類和非整合素類）的結(jié)合，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的黏附和遷移7。Lugassy等用內(nèi)皮細(xì)胞形成類管腔結(jié)構(gòu)并與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可沿著管腔外表面前行，并包繞在血管基底膜成分LN的外周8。提示本研究

15、中的LN5可能在影響膠質(zhì)瘤顱外轉(zhuǎn)移的同時，還誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿著血管基膜向正常腦組織遷移。此外，在臨床和不同動物實驗中也觀察到腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞還常沿有髓纖維（束內(nèi)、束周及束間）侵襲，研究表明雖然腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系能特異地粘附到中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂提取物，但比粘附到純化的LN上明顯要慢9。 呂德蘭血型糖蛋白（Lu），也稱為基底細(xì)胞黏附分子（BCAM），是表達(dá)于紅細(xì)胞膜上的一種LN受體，屬于免疫球蛋白超家族，研究表明它與LN的高親和力結(jié)合有助于器官發(fā)生、血管形成、紅細(xì)胞生成，研究還表明它在一些疾病和惡性腫瘤中高表達(dá)，并和其它的黏附受體一起涉及到腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移1011。Kikkawa等研究發(fā)現(xiàn)在ECM蛋白

16、中，僅僅含5鏈的LN是Lu/BCAM的配體12。本研究發(fā)現(xiàn)LN5除了在血管內(nèi)皮細(xì)胞和基膜表達(dá)外，還在紅細(xì)胞膜上呈陽性染色，膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移瘤標(biāo)本中紅細(xì)胞膜上染色遠(yuǎn)強于正常腦組織，膠質(zhì)瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間染色無明顯差異。提示高表達(dá)的LN5結(jié)合到紅細(xì)胞膜受體上，其來源有可能是內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌的，LN5與Lu/BCAM相互作用在紅細(xì)胞運輸、腫瘤營養(yǎng)、血管內(nèi)皮增生/新血管生成等過程中可能起重要作用。 不過，要確切地搞清楚是哪些LN亞基在腦膠質(zhì)瘤的那些生物學(xué)行為中起作用？作用如何？分子機制何在？還需要借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)（基因敲除，基因轉(zhuǎn)染、RNAi干擾技術(shù)等）在體內(nèi)外實驗（黏附、遷移、侵襲實驗）中進(jìn)一步研究

17、?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Colognam H,Yurchenco P D. Form and funcation：the laminin family of heterotrimersJ. Dev Uyn, 2000,218:213234.2 江常震,陳錦鋒,何理盛,等. 層黏連蛋白,MMP2、MMP9及TIMP1在人腦原發(fā)性膠質(zhì)瘤的表達(dá)及臨床意義J. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2001,35(1):49.3 林志雄,張鵬飛,江常震,等. 人腦膠質(zhì)瘤中LN、FN及p53基因蛋白的免疫組織化學(xué)與其侵襲微生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)性探討J. 解剖學(xué)報, 2002,33(4):360365.4 陳菊祥,盧亦成, 駱 純,

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