復(fù)合變選育高產(chǎn)3-羥基丁酮枯草芽孢桿菌

1、復(fù)合誘變選育高產(chǎn)3-羥基丁酮枯草芽孢桿菌第25卷第3期2021年9月青島大學(xué)(工程技術(shù)版)JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(E&T)Vo1.25NO.3Sep.2021文章編號(hào):10069798(2021)03008906復(fù)合誘變選育高產(chǎn)3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌尹明浩,徐慧.,程殿林,王勇(1.青島大學(xué)生物系,山東青島266071;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)摘要:選育高產(chǎn)3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌,將一株枯草芽孢桿菌YD一1作為出發(fā)菌株,通過(guò)紫外線(xiàn),硫酸二乙酯反復(fù)誘變處理,選取每一輪發(fā)酵3一羥基丁酮產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)入下一輪誘變.結(jié)果說(shuō)明,

2、菌株的復(fù)合誘變條件是在照射距離為25cm時(shí)紫外誘變30S后再經(jīng)10%的硫酸二乙酯誘變處理30min,然后進(jìn)行有利突變株的篩選,通過(guò)初篩,復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn),獲得1株遺傳性狀穩(wěn)定的3一羥基丁酮高產(chǎn)菌,其產(chǎn)量高達(dá)19.02g/L,比誘變前提高了5O.95,其遺傳物質(zhì)經(jīng)RAPD分析,與出發(fā)菌株YD一1相比有較大差異.得到的枯草芽孢桿菌新菌株3一羥基丁酮產(chǎn)量高而殘?zhí)橇康?關(guān)鍵詞:3一羥基丁酮;枯草芽孢桿菌;復(fù)合誘變;RAPD中圖分類(lèi)號(hào):Q939.97文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A3一羥基丁酮具有特有的奶油香味,除了用作奶油,干酪,咖啡的香味增強(qiáng)劑外,還可作為一種重要的化合物來(lái)合成多種稀有藥物和藥物中間體,制造特香型

3、烤煙等.作為一種食用香料,我國(guó)GB2760-86已明確規(guī)定允許其食用口.目前,3一羥基丁酮的生產(chǎn)方法主要有3種:化學(xué)合成法,酶法轉(zhuǎn)化和微生物生產(chǎn)法.化學(xué)合成法和酶法轉(zhuǎn)化都是以丁二酮或2,3一丁二醇為原料E,區(qū)別在于酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)物得率高,沒(méi)有其它副產(chǎn)物,但要獲得大量特異性的酶比擬困難.丁二酮和2,3一丁二醇本身也是合成香料,而非大宗化工產(chǎn)品,原料來(lái)源及價(jià)格都受到限制,這是當(dāng)前限制3一羥基丁酮大規(guī)模生產(chǎn)的原因之一.與前二者相比,微生物發(fā)酵法具有工藝簡(jiǎn)單,條件溫和,原料來(lái)源廣泛,價(jià)格廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn),是3一羥基丁酮最有潛力的生產(chǎn)方法.但目前有關(guān)微生物生產(chǎn)3一羥基丁酮的文獻(xiàn),大多為代謝途徑理論方面的研究,少數(shù)

4、涉及3一羥基丁酮生產(chǎn)的報(bào)道也主要是作為丁二酮和2,3一丁二醇發(fā)酵的副產(chǎn)物提及_3.因此,誘變篩選一株高產(chǎn)3一羥基丁酮的菌株具有極其重要的科研意義和現(xiàn)實(shí)意義.本實(shí)驗(yàn)采用紫外一硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法,選育出一株高產(chǎn)3一羥基丁酮的枯草芽孢桿菌.1材料與方法1.1材料,主要試劑及儀器1.1.1出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)YD一1,本實(shí)驗(yàn)室保存.1.1.2主要培養(yǎng)基1)斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5;硫酸錳0.1;蛋白胨10;氯化錳1;瓊脂20;pH7.0.2)種子培養(yǎng)基(g/I):葡萄糖80;硫酸銨1;酵母粉5;玉米漿10;磷酸氫二鉀1;pH7.0.3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L

5、):葡萄糖120;玉米漿10;酵母粉5;硫酸銨l_5;硫酸錳0.05;pH.3試劑收稿日期:20210505作者簡(jiǎn)介:尹明浩(1984一),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸锕こ?通訊作者:程殿林,教授.Email:chengdianlin163.eom90青島大學(xué)(工程技術(shù)版)第25卷10的硫酸二乙酯(DES):取0.2mL硫酸二乙酯,參加1.8mI無(wú)水乙醇,混合均勻;25硫代硫酸鈉:硫代硫酸鈉25g,用水定容至100mL;緩沖液:0.2MNaHPONaHP,pH7.0;隨機(jī)引物由上海生物工程公司合成,共2O個(gè)引物;TaqDNA聚合酶,dNTPs,RNase購(gòu)自大連寶生物工程公司

6、;其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝取斜面菌種一環(huán),接種于盛有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,180r/rain,37搖床培養(yǎng)18h.取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入另一只盛有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,37搖床培養(yǎng)3d.1_2.2肌酸甲奈酚法測(cè)定3一羥基丁酮-在堿性條件下,3一羥基丁酮可與肌酸和甲萘酚生成粉紅色復(fù)合物,該復(fù)合物在530nm處有最大吸收峰.取8支干凈比色管分別加人3一羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和顯色劑,6O顯色反響15min,721分光光度計(jì)530nm測(cè)吸光值(OD值),以O(shè)D值為縱坐標(biāo),3一羥基丁酮含量為橫坐標(biāo)繪制3一羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),如圖1所示.計(jì)算

7、公式為T(mén)一00224V××10lV式中,丁為3一羥基丁酮含量,g/L;V為樣品體積,mL;A涮為吸光度;為稀釋倍數(shù).1.2.3復(fù)原糖濃度的測(cè)定利用DNS法I6測(cè)定復(fù)原糖含量.1.2.4紫外誘變及菌株篩選將培養(yǎng)6h的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋,調(diào)整細(xì)胞質(zhì)量濃度為1x1O個(gè)/mL,取1OmL置于9cm培養(yǎng)皿中(內(nèi)置3一羥基丁酮質(zhì)量仉g圖13一羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)一滅菌處理的磁力攪拌針),置于紫外誘變箱的磁力攪拌器上,調(diào)整照射距離為25cm,翻開(kāi)皿蓋,分別照射lO,20,3O,4O,5O,6O,7O,8O,90,100s.取不同誘變時(shí)間的菌懸液】mL,稀釋到比誘變前少一個(gè)稀釋度,取0.1mL

8、誘變液涂布平板,每個(gè)稀釋度作三皿平行試驗(yàn),在37下培養(yǎng)3d.待菌落長(zhǎng)出后,計(jì)算每皿菌落數(shù),計(jì)算誘變后存活細(xì)胞濃度,繪制致死曲線(xiàn).1.2.5DES誘變將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液梯度稀釋,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL,取5mL置于250mL碘量瓶中,參加pH7.0的磷酸緩沖液5mI,10%的DES0.1mL,于37下震蕩培養(yǎng)10,20,30,4O,5O,60min,處理完畢后立即參加1mL25的硫代硫酸鈉溶液終止反響,適當(dāng)稀釋后涂布平板,37恒溫培養(yǎng).1.2.6枯草芽孢桿菌基因組DNA的提取7取培養(yǎng)24h的枯草芽孢桿菌菌懸液1mI,10000r/min離心1min,沉淀以500LTE充

9、分懸浮后加入1OL溶菌酶于37水浴保溫30min;加5OL1O的SDS溶液和5L蛋白酶K,充分混勻后置56水浴3h;加等體積的飽和酚,充分混勻,12000r離心10min,抽取上清液加等體積的飽和酚:氯仿(1:1),重復(fù)抽提一次;取上清液加1/10體積的3mol/L的醋酸鈉(pH5.2)和1LRnaseA充分混勻,37放置2h;12000r離心10rain,棄上清后,參加500L70的乙醇洗滌兩次;12000轉(zhuǎn)離心10min,棄上清,置于超凈工作臺(tái)中枯燥,沉淀溶于5OLTE中;將提取的各酵母菌株DNA按紫外吸收法檢測(cè)0D.和0D.,并計(jì)算其濃度.1.2.7RAPD分析以提取各枯草芽孢桿菌菌株D

10、NA為模板,用不同的隨機(jī)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增.25L反響體系中參加1O/zgDNA模板,10×PCRBuffer2.5L,25mmol/LMgL,Taq酶5U,2.5mmol/LdNTPs3I,20/mol/L隨機(jī)引物1L,加ddw至總體積25I,于基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增反響.反響程序:94預(yù)變性4min;94變性1rain,36退火1min,72延伸2rain進(jìn)行35個(gè)循環(huán);再72延伸10min.反響一一/一/4.葉葉格第3期尹明浩,等:復(fù)合誘變選育高產(chǎn)3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌91結(jié)束后,取擴(kuò)增產(chǎn)物10L于1瓊脂糖凝膠中電泳,EB染色30min后紫外燈下觀(guān)察并拍照記錄結(jié)果.2結(jié)果與

11、討論2.1繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)挑取枯草芽孢桿菌菌株YD一1菌落于裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mI三角瓶中,180r/min,37下培養(yǎng)不同時(shí)間后,530nm下測(cè)定OD值,得到枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn),如圖2所示.可以看出,新接種的枯草芽孢桿菌YD一1在培養(yǎng)的前2h中生長(zhǎng)緩慢,37培養(yǎng)2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,持續(xù)增長(zhǎng)直到培養(yǎng)8h后到達(dá)穩(wěn)定期.2.2紫外誘變參考圖2所得結(jié)果,取培養(yǎng)6h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期枯草芽孢桿菌YD一1菌懸液5mI,按照1.2.4中所述方法進(jìn)行誘變處理,致死曲線(xiàn)如圖3所示.可以看出,枯草芽孢桿菌菌懸液接受紫外線(xiàn)照射時(shí),致死率變化較為明顯,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),YD一1的致死率呈不斷升高趨勢(shì),在處理

12、時(shí)間超過(guò)40S后,致死率變化趨向平緩,處理60s后致死率已接近100oA.目前傾向于認(rèn)為在較低的致死率下,正向突變的幾率更高9.對(duì)于紫外誘變,致死率在7585%之間時(shí)誘變劑量相對(duì)較低,本實(shí)驗(yàn)選擇80的致死率,相應(yīng)誘變時(shí)間為30S.誘變菌株經(jīng)過(guò)兩輪復(fù)篩,從中選取高產(chǎn)菌株,將其命名為M一3O并保存,進(jìn)行下一步誘變.凸0時(shí)間t/h圖2枯草芽孢桿菌YD一1生長(zhǎng)曲線(xiàn)2.3硫酸二乙酯(DES)誘變2.3.1繪制硫酸二乙酯致死曲線(xiàn)在37搖床中對(duì)M一3O用DES處理不同時(shí)間后,涂布于瓊脂平板,37恒溫培養(yǎng)2d后,以平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù),繪制DES致死曲線(xiàn)如圖4所示.由圖可以看出,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),菌株的

13、死傷程度增加,其細(xì)胞存活率明顯下降,經(jīng)過(guò)DES處理2O,3O,40rain后,M一3O的致死率分別為66,85和正交實(shí)驗(yàn)確定DES誘變參數(shù)蚪旃旃旃誘變時(shí)間,/s圖3紫外誘變致死曲線(xiàn)0圖4DES致死曲線(xiàn)DES誘變的影響因素有誘變溫度,DES濃度和處理時(shí)間,以此為條件做3因素3水平正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表1和表2所示.由表2中極差分析可以看出,對(duì)M一30的DES誘變效果影響因素依次為DES濃度>處理時(shí)間>誘變溫度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說(shuō)明,A.B.C組為最正確組合.即DES處理?xiàng)l件最優(yōu)組合為:DES質(zhì)量濃度為1l7.7g/L,處理時(shí)間為30min,處理溫度為37.表1D

14、ES誘變枯草芽孢桿菌的因素及水平92青島大學(xué)(工程技術(shù)版)第25卷2.3.3復(fù)合誘變正突變菌株的選出將活化后的M一3O按上述條件進(jìn)行誘變處理,即DES質(zhì)量濃度為1l7.7g/L,在37下,振蕩處理30min,速加過(guò)量硫代硫酸鈉溶液中止反響,吸取誘變后的菌0.1mL涂布于瓊脂平板,37恒溫培養(yǎng)2d挑菌,進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn).透過(guò)反復(fù)篩選,得到3一羥基丁酮產(chǎn)量較高的突變菌株10株,分別命名為s一1s一10,發(fā)酵3d后,將搖瓶發(fā)酵液補(bǔ)蒸餾水恢復(fù)原體積30mL,按照1.2.2所述方法測(cè)定其3一羥基丁酮產(chǎn)量,結(jié)果如表3所示.表2各因素對(duì)DES誘變效果的正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)號(hào)誘變溫度/lDES質(zhì)量濃度/(g?L一)123

15、l23123處理時(shí)間/3mln123231312羥基丁酮產(chǎn)量/(g?L一)表3各菌株發(fā)酵結(jié)果分析比擬菌株3一羥基丁酮/(g?L)殘?zhí)?菌株3一羥基丁酮/(g?L-1)殘?zhí)?YD一112.6O0.87S一518.690.70M一3O15.780.88S一617.210.68S一118.450.46S一718.030.59S一117.220.65S一817.660.41S一318.760.66S一918.780.32S一416.960.76S一1019.O20.45由表3可以看出,經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選所得到的絕大局部菌株,其3一羥基丁酮產(chǎn)量均有不同程度的提高,其中,S一1O的產(chǎn)量在19.00g/L左右,提

16、高幅度較大(如表4所示)且菌株的殘?zhí)橇恳草^低,較之其他枯草芽孢桿菌菌株具有很大的發(fā)酵優(yōu)勢(shì),因此,選取該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).2.4遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將誘變所得突變株S一1O在斜面上連續(xù)傳代8次,按照】.2.1中所述方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),按1.2.2及1.2.3中所述方法測(cè)定3一羥基丁酮和殘?zhí)?結(jié)果如表5所示.由表5可以看出,S10遺傳穩(wěn)定性良好,各代間幾乎無(wú)差異,在連續(xù)傳代8次之后,發(fā)酵產(chǎn)物中3一羥基丁酮含量仍保持在19.00g/L左右,無(wú)太大波動(dòng),殘?zhí)呛康颓曳€(wěn)定,具備作為生產(chǎn)菌株的潛力.2.5RAPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4出發(fā)菌株與誘變菌株3一羥基丁酮產(chǎn)量比擬表5S一10遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)代數(shù).一.丁量殘?zhí)琴|(zhì)

17、量分?jǐn)?shù)/2O個(gè)隨機(jī)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn),只有5個(gè)隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物有條帶出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果如圖5所示.23456789一I一一R第3期尹明浩,等:復(fù)合誘變選育高產(chǎn)3一羥基丁酮枯草芽孢桿菌93圖5中,每一隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物左側(cè)為出發(fā)菌株YD一1,右側(cè)為S一1O.每條隨機(jī)引物以YD一1和S一10全基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中第4條隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果最為顯著,這充分說(shuō)明經(jīng)化學(xué)誘變所得到的S一10與出發(fā)菌株相比遺傳特性發(fā)生了一定改變.3結(jié)束語(yǔ)物理誘變,化學(xué)誘變是誘變微生物,篩選優(yōu)良菌株的有效手段.硫酸二乙酯和紫外線(xiàn)作用機(jī)理不同,但均可誘導(dǎo)微生物細(xì)胞中的DNA發(fā)生突變,從而影響微生

18、物的原有性狀,使其具有新的特性.筆者采用物理誘變劑紫外線(xiàn)和化學(xué)誘4500300020001200800500200圖5RAPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果變劑硫酸二乙酯對(duì)枯草芽孢桿菌YD一1進(jìn)行復(fù)合誘變.照射距離為25cm,紫外誘變30s后的菌懸液用質(zhì)量濃度10的硫酸二乙酯誘變處理3Omin,通過(guò)初篩,復(fù)篩獲得了一株3一羥基丁酮高產(chǎn)菌株S一10,產(chǎn)量高達(dá)19.02g/L,比誘變前提高了50.95.遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該菌遺傳性能穩(wěn)定,殘?zhí)呛枯^低,同時(shí)利用RAPD技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株YD一1及S一10進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間確實(shí)存在遺傳物質(zhì)差異,由此得到一株高產(chǎn)3一羥基丁酮且遺傳穩(wěn)定性良好的枯草芽孢桿菌新菌株.對(duì)其

19、更深入的研究,尚需進(jìn)一步工作完成.參考文獻(xiàn):1凌關(guān)庭.食品添加劑手冊(cè)(2版)M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1997.2張小舟,曾崇余,任曉乾.乙偶姻合成研究現(xiàn)狀及展望J.江蘇化工,2001,29(4):2931.3GuptaKG,YadavNK,DhawanS.LaboratoryScaleProductionNofacetoInplusDiacetylbyEnterobacterCloacaeATCC27613J.BiotechnologyandBioengineering,1978,20(12):18951901.4UiS,MasudaH,MurakiH.Laboratory-ScalePnx

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23、n一/in.WANGYong(1.BiologyDepartmentofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2?CollegeofBioengineeringTianjinUniversityofScienceandTeehnology,Tianjin300457,China)Abstract:Theaimofthisstudywastobreednewstrainswhichhavehigherproductionofacetoin.WithaBacillussubtilisastheoriginalstrain,andundermutationbyu

24、ltraviolet(UV)anddiethy1suIfate(DES).weusethehighestacetoinproducingStrainofBacillussubtilisineachmutationtreatmenastheorigina1strainnthenextmutation?ThecompoundmutationconditionofYD一1strainwasthatafterthestartingtainwasmutatedbyultravioletfor30satthedistanceof25cm,itwasmutatedby10%diethy1suIfatefor

25、30rain,thentheavailablemutantwasscreenedandaHighacetoin-producingStrainofB口cillsbtiliswithstablegeneticcharacterswasobtainedthroughtheprimaryscreeffing,secondarysereeningandthege-netlestabilityexperiment.Theaeetoinproductionwas19.02g/L,whichwas5O.95higherthanthetartingstrain?Thegeneticsubstancesoftw

26、ostainsweredifferentthroughRAPDanalysis.AnewB口cillussubtiliswithhighacetoinproductionandlowresidualsugarwasobtained.Keywords:acetoin;Bacillussubtilis;compositmutation;RAPD(從第88頁(yè)轉(zhuǎn)來(lái))StudyontheTemperatureFieldstributionfortheConstantVolumeCombustionBombZHAOYulei,ZHANGJipeng,(CollegeofMechanicalandElectronicEngineering,WANGDechang,HUOWeiQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)Abstract:Basedontheconstan