核酸分子雜交研究生課程

1、2021/3/2322021/3/233 單鏈的核酸分子在合適的條件下單鏈的核酸分子在合適的條件下, ,與具與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱體的過程稱核酸分子雜交（核酸分子雜交（molecular molecular hybridizationhybridization）2021/3/2342021/3/235變性變性復(fù)性復(fù)性2021/3/236DNADNA加熱變性加熱變性DNADNA冷卻復(fù)性冷卻復(fù)性DNA/RNADNA/RNA雜交雜交TmTm(melting temperature)(melting temperature) :DNA :

2、DNA從部分變性到完全變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)進行從部分變性到完全變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)進行, ,這一溫度范圍的中點稱為熔點溫度。這一溫度范圍的中點稱為熔點溫度。2021/3/2372021/3/2382021/3/2392021/3/23102021/3/23112021/3/23122021/3/23132021/3/23142021/3/23152021/3/23162021/3/23172021/3/23182021/3/23192021/3/23202021/3/23212021/3/2322 DNADNA探針探針是最常用的核酸探針是最常用的核酸探針,長度在長度在幾百幾百b

3、p以上的雙鏈或單鏈以上的雙鏈或單鏈cDNA片段（片段（通常通常400500bp）放射性或非放射性標記的放射性或非放射性標記的RNARNA分子分子, ,用用于探測與之互補的于探測與之互補的DNADNA或或RNARNA鏈鏈,RNA,RNA探探針通常通過克隆相應(yīng)針通常通過克隆相應(yīng)DNADNA在體外轉(zhuǎn)錄合在體外轉(zhuǎn)錄合成而制備成而制備（通常（通常400400500bp500bp） RNARNA探針探針 寡核苷酸寡核苷酸探針探針一般有一般有17-5017-50個核苷酸組成個核苷酸組成, ,可以是寡聚脫氧核醣核酸、可以是寡聚脫氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸寡聚核糖核酸和肽核酸2021/3/23232021

4、/3/23242021/3/2325 隨機引物標記隨機引物標記 DNADNA缺口平移標記缺口平移標記 全程全程RNARNA探針標記探針標記 化學(xué)法全程標記化學(xué)法全程標記 3 3末端標記末端標記 5 5末端標記末端標記 隨機引物標記隨機引物標記最常用最常用DNADNA模板模板引物和模板引物和模板DNADNA結(jié)合結(jié)合加入加入klenow片斷、片斷、3種種dNTP和和1種標記種標記dNTP引物延伸引物延伸標記的標記的DNA 片段片段未標記的未標記的DNA 模板模板DNaseDNA聚合酶聚合酶（53核酸外切酶活性核酸外切酶活性53 聚合酶活性）聚合酶活性）3dNTP1dNTP#DNaseDNA聚合酶聚

5、合酶（53核酸外核酸外切酶活性切酶活性53 聚合酶活性聚合酶活性）模板模板DNADNA切開模板切開模板DNADNA形成一到幾個堿形成一到幾個堿基的缺口基的缺口摻入標記基團摻入標記基團缺口平移缺口平移DNA缺口平移標記缺口平移標記在處酶切在處酶切在處酶切在處酶切從從T7啟動子轉(zhuǎn)錄啟動子轉(zhuǎn)錄從從SP6啟動子轉(zhuǎn)錄啟動子轉(zhuǎn)錄全程全程RNARNA探針標記探針標記 化學(xué)法全程標記化學(xué)法全程標記( (生物素或地高辛標記生物素或地高辛標記) ) 與地高辛標記的探針雜交與地高辛標記的探針雜交加入與堿性磷酸酶結(jié)合的加入與堿性磷酸酶結(jié)合的抗地高辛抗體抗地高辛抗體加入加入底物底物BCIP/ NBTCSPD末端標記末端

6、標記3-末端標記末端標記53355末端突出的末端突出的DNA55333末端標記的末端標記的DNA完整雙鏈完整雙鏈DNAKlenowDNA聚合酶聚合酶32pdNTP變性變性32p末端標記的末端標記的單鏈單鏈DNA探針探針末端標記末端標記5-末端標記末端標記2021/3/23322021/3/23332021/3/2334 （一）液相雜交（一）液相雜交 （二）固相雜交（二）固相雜交 （三）原位雜交（三）原位雜交 （四）基因芯片技術(shù)（四）基因芯片技術(shù)點雜交點雜交/ /狹縫雜交狹縫雜交菌落雜交菌落雜交Northern Northern 雜交雜交SouthernSouthern雜交雜交反點向雜交反點向雜

7、交一、MASA液態(tài)芯片二、二、雜交的基本分類雜交的基本分類 MASA是一種在懸浮液態(tài)體系中進行的生物分子是一種在懸浮液態(tài)體系中進行的生物分子間反應(yīng)間反應(yīng), ,并以并以100100種不同熒光編碼的微球作為探針種不同熒光編碼的微球作為探針的一類新型生物芯片技術(shù)。它集合了流式細胞技的一類新型生物芯片技術(shù)。它集合了流式細胞技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)、激光技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)、激光技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體術(shù)為一體, ,是一種新型生物分子檢測技術(shù)。其反應(yīng)是一種新型生物分子檢測技術(shù)。其反應(yīng)體系中可以進行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸體系中可以進行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的檢測等生物的檢測

8、。MASAMASA技術(shù)的原理技術(shù)的原理是是用不同的熒光顏色用不同的熒光顏色對乳膠顆粒進行編對乳膠顆粒進行編碼使之具有檢測多碼使之具有檢測多個靶分子的能力個靶分子的能力 二、二、雜交的基本分類雜交的基本分類 概念概念: :反向點雜交反向點雜交(reverse dot blot, (reverse dot blot, RDB)RDB)是是SaikiSaiki等提出的一種斑點雜交技術(shù)等提出的一種斑點雜交技術(shù), ,是將是將探針固定在玻璃芯片或尼龍膜上，用于檢測擴探針固定在玻璃芯片或尼龍膜上，用于檢測擴增產(chǎn)物中是否含有目標基因的技術(shù)。增產(chǎn)物中是否含有目標基因的技術(shù)。 原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用: :RDBRD

9、B是先將待用的探針分別點到硝酸纖是先將待用的探針分別點到硝酸纖維素膜或尼龍膜上維素膜或尼龍膜上, ,每個探針一個點并編上號每個探針一個點并編上號, ,再將再將待測的待測的DNADNA樣本樣本( (一般是經(jīng)一般是經(jīng)PCRPCR特異性擴增的產(chǎn)物，在特異性擴增的產(chǎn)物，在PCRPCR引物引物55端預(yù)先進行生物素標記，使擴增產(chǎn)物相端預(yù)先進行生物素標記，使擴增產(chǎn)物相應(yīng)標記有生物素應(yīng)標記有生物素) )與之雜交與之雜交; ; 待檢樣本就會與具有同源序列的探針結(jié)合待檢樣本就會與具有同源序列的探針結(jié)合,經(jīng)洗滌去除未經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的結(jié)合的DNA樣本樣本,由于待測的由于待測的DNA樣本具有生物素類的標記樣本具有生物

10、素類的標記物，結(jié)合了待測物，結(jié)合了待測DNA的探針點上就帶有生物素類的標記物，的探針點上就帶有生物素類的標記物，再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號。再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號。 一次就可以判斷某一基因座位的大部分或全部等位基因，一次就可以判斷某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用這樣的工作原理還可以用于基因分型、病原體檢測、因此利用這樣的工作原理還可以用于基因分型、病原體檢測、腫瘤研究等。腫瘤研究等。 2.Southern blot2.Southern blot3.Northern blot3.Northern blot4.4.點雜交和狹縫雜交點雜交和狹縫雜交5.5.熒光原位雜交

11、熒光原位雜交6.6.基因芯片基因芯片1.1.菌落雜交菌落雜交2021/3/23452.Southern blot2.Southern blot2021/3/23462.Southern blot2.Southern blotDNA片段在瓊脂片段在瓊脂糖凝膠上電泳分糖凝膠上電泳分離離膜上固定膜上固定DNA片段片段在緩沖液中將在緩沖液中將標記的探針加標記的探針加到膜上到膜上DNA片段從瓊脂片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上膜上雜交信號的雜交信號的檢測檢測2.Southern blot2.Southern blot2021/3/23482021/3/23492021/3/23502021/3

12、/23512021/3/23522021/3/23532021/3/23542021/3/23552021/3/23562021/3/23572021/3/23582021/3/23592021/3/23603.Northern3.Northern印跡雜交印跡雜交2021/3/2361DNADNA樣品點到濾膜上樣品點到濾膜上1 1 變性變性2 2 中和中和3 3 固定固定DNADNA4 4 與標記探針雜交與標記探針雜交5 5 洗脫與顯影洗脫與顯影探針探針DNADNA探針標記探針標記 變性變性將探針加到固定的將探針加到固定的DNADNA上上2021/3/23632021/3/23642021/3

13、/23652021/3/23662021/3/23672021/3/23682021/3/23692021/3/23702021/3/2371熒光原位雜交熒光原位雜交熒光原位雜交熒光原位雜交 FISH FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實驗技術(shù)技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實驗技術(shù), ,其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標記的寡聚核針或采用間接法用生物素、地高辛等標記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細胞或組織中的核酸苷酸探針與變性后的染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進行雜交按照堿基互補配對原則進行雜交, ,經(jīng)變性經(jīng)變性退火退火復(fù)復(fù)性性洗滌后即可形成靶洗滌后即可形成靶DNA DNA 與核酸探針的雜交體，與核酸探針的雜交體，直接檢測或通過免疫熒光系統(tǒng)檢測，最后在熒光顯直接檢測或通過免疫熒光系統(tǒng)檢測，最后在熒光顯微鏡下顯影，即可對待測微鏡下顯影，即可對待測DNADNA進行定性、定量或相對進行定性、定量或相對定位分析。定位分析