葉綠素的提取與含量測(cè)定

1、才巧y丿叨實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：成績(jī):實(shí)驗(yàn)名稱：葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)和葉綠素含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)類型同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┤?、?shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?. 掌握植物中葉綠體色素的提取分離和性質(zhì)鑒定。2. 掌握定量分析的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理：以青菜為材料，提取和分離葉綠體色素并進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定和葉綠素含量分析。 原理如下：1. 葉綠素和類胡蘿卜素均不溶于水而溶于有機(jī)溶劑，常用95%

2、的乙醇或80%的丙 酮提取。2. 皂化反應(yīng)。葉綠素是二撥酸酯，與強(qiáng)堿反應(yīng)，形成綠色的可溶性葉綠素鹽，就可與有機(jī)溶劑中的類胡蘿卜素分開(kāi)。3. 取代反應(yīng)。在酸性或加溫條件下，葉綠素嚇咻環(huán)中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去鎂葉綠素和綠色的銅代葉綠素。4. 葉綠素受光激發(fā)，可發(fā)出紅色熒光，反射光下可見(jiàn)紅色熒光。5. 定量分析。葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫光，紅光區(qū)可用于定量分析，其中645和663用于定量葉綠素a, b及總量，而652可直接用于總量分析。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑材料：青菜葉試劑：KOH固體、醋酸銅粉末、醋酸四、主要儀器設(shè)備：1. 天平（萬(wàn)分之一）、可掃描分光光度計(jì)、離心機(jī)2. 研具

3、、PE管、酒精燈等五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）1. 定性分析：熒光現(xiàn)象：鮮葉3-5g+95%乙醇15ml （逐步加入），磨成勻漿,過(guò)濾入三角瓶, 觀察熒光現(xiàn)象皂化反應(yīng)：加KOH數(shù)片劇烈搖均，加石油瞇lml和H:0 lml,分層后觀察取代反應(yīng)：加醋酸約lml,觀察顏色，取1/2加醋酸銅粉，加熱變 亮綠 色2. 葉綠素和類胡蘿卜素的吸收光譜測(cè)定：皂化反應(yīng)的上層黃色石油醸溶液（稀釋470nm 0D ）,在400-700nm處掃描光譜，分別測(cè)定類胡蘿卜素的吸收峰反復(fù)用石油瞇粹取，直到無(wú)類胡蘿卜素，離心得葉綠素（鹽），（稀釋663nm0D ）,分別測(cè)定葉綠素的吸收峰3 葉綠素定量分析：鮮葉，力口，磨成

4、勻漿，取2份加80%丙酮,搖勻，4000轉(zhuǎn)離心3min,上清液在645, 652, 663測(cè)定OD,計(jì)算Chia, Chib和Chi總量的値。六. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1.熒光現(xiàn)象：透射光綠色，反射光 紅光2皂化反應(yīng)：上層呈黃色,為類胡蘿卜素，吸收藍(lán)紫光。下層呈綠色。為葉綠素。吸收藍(lán)紫光和紅光。皂化反應(yīng)分層3. 類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測(cè)定:上層黃色溶液掃描光譜吸收峰為 468nm> 439nm 413nm> 667nm 和 606nm 五個(gè) 下層綠色溶液掃描光譜去鎂葉綠素銅代葉綠吸收峰為414nm> 526nm、639nm三個(gè)4. 取代反應(yīng):加醋酸約lml,變褐（去鎂 葉

5、綠素） 取1/2加醋酸銅粉加熱變亮綠色,為銅代葉綠素。素5. 葉綠素含量測(cè)定波長(zhǎng)/nm吸光度（第一組）吸光度（第二組）645652663根據(jù)公式：CagL二 0D645Cksb/L>= 0D652? 1000/Chia 含量（mg/二（ca（a,.1）/1000）?2/ ?5/Chib 含量（mg/ =（Ct/1000） ?2/ ?5/Chi總含量（mg/ =（Ct）/1000）?2/ ?E求得：C&產(chǎn) mg/ LC&2二 nig/ LCb 產(chǎn) mg/ LCb：= mg/LCn= mg/LCt： mg/LChia 含量 1 = mg/Chia 含量 1 = mg/Chib

6、 含量 1 = mg/Chib 含量 1= mg/Chi總含量1= mg/Chi總含量1= mg/七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析類胡蘿卜素和葉綠素的吸收光譜測(cè)定：類胡蘿卜素的吸收峰為藍(lán)紫光區(qū)468nm> 439nm、413nm三個(gè)峰，在紅光區(qū)667nm和606nm的峰說(shuō)明葉綠素有殘留。葉綠素在藍(lán)紫光區(qū)有414nm、526nm兩個(gè)峰，在紅光區(qū)有639nm 個(gè)峰，藍(lán)紫光區(qū)的 峰比紅光區(qū)的高，說(shuō)明葉綠素吸收藍(lán)紫光的能力比紅光強(qiáng)。葉綠素含量測(cè)定：Chia 含量 1 = mg/ Chia 含量 1 = mg/Chib 含量 1 = mg/ Chib 含量 1= mg/Chi總含量1= mg/ Chi總含量1=

7、 mg/兩組測(cè)定結(jié)果中葉綠素a與葉綠素b含量之和與用663nm求得的總?cè)~綠素含量比較 接近，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想，可能造成實(shí)驗(yàn)誤差的因素有：1. 研磨后的葉綠素溶液中仍存在固體，可能堵塞移液槍管口，造成吸入的溶液量不準(zhǔn)確2. 比色皿未清洗干凈，造成測(cè)得的吸光度改變3. 分光光度計(jì)存在儀器誤差八、討論、心得思考題：1. 為什么葉綠素吸收紅光和藍(lán)紫紫光葉綠素的能級(jí)有基態(tài)（G）,第一單線激發(fā)態(tài)（E1）,第二單線激發(fā)態(tài)（E2）和三 線激發(fā)態(tài)（E3）,光子吸收必須遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必須等于基態(tài)和 激發(fā)態(tài)的能量差。藍(lán)紫光能量大，可使葉綠素分子中的電子躍遷到E2,而紅光能量 小，只能使其躍遷到E1,故葉綠素只能吸收藍(lán)紫光和紅光。2. 為什么可用皂化后的葉綠素鹽來(lái)測(cè)定葉綠素的吸收光譜因?yàn)橛捎谌~綠素皂化反應(yīng)后的葉綠素鹽并不影響葉綠素分子的骨架結(jié)構(gòu)，葉綠 素對(duì)光的吸收規(guī)律與葉綠素鹽對(duì)光的吸收規(guī)律兒乎是相同的，而且皂化反應(yīng)可以從 葉綠體色素中只篩選出葉綠素，排除了其他色素的干擾，所以可用皂化后的葉綠素 鹽來(lái)測(cè)定葉綠素的吸收光譜。討論:1皂化反應(yīng)后的黃色溶液需用石油瞇萃取多次，如果萃取補(bǔ)充分，會(huì)有葉綠素殘留， 在掃描吸收光譜時(shí)除了在468nm、439nm、413