限制性內(nèi)切酶 (1)

1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 制作人：郜原制作人：郜原 日日 期：期：2010-3-312010-3-31簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction (restriction endonuclease):endonuclease):識(shí)別并切割識(shí)別并切割特異的雙鏈特異的雙鏈DNADNA序列的一種內(nèi)序列的一種內(nèi)切核酸酶。切核酸酶。 別名別名 EndodeoxyribonucleaseEndodeoxyribonuclease 酶反應(yīng)酶反應(yīng) 限制性內(nèi)切酶能分限制性內(nèi)切酶能分裂裂DNADNA分子在一限定數(shù)目的專分子在一限定數(shù)目的專一部位上。它能識(shí)別外源一部位上。它能識(shí)別外源D

2、NADNA并將其降解。并將其降解。 單位定義單位定義 在指明在指明pHpH與與3737，在，在0.05mL0.05mL反應(yīng)混合物中，反應(yīng)混合物中，1 1小時(shí)消化小時(shí)消化1g1g的的DNADNA的酶量為的酶量為1 1單位。單位。定義和命名定義和命名DNADNA限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶：生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNADNA序列的一種內(nèi)切核酸序列的一種內(nèi)切核酸酶。它可以將外來的酶。它可以將外來的DNADNA切斷的酶，即能夠限制異源切斷的酶，即能夠限制異源DNADNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DNADNA卻無損害作用，這卻無損

3、害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNADNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶( (簡(jiǎn)稱限制酶簡(jiǎn)稱限制酶) )。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名；一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母限制性核酸內(nèi)切酶的命名；一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株( (品系品系) )。例。例如，從如，從Bacillus amylolique faciens HBacillus amylolique faciens H中提取的限制性中提取的限制性內(nèi)

4、切酶稱為內(nèi)切酶稱為Bam HBam H，在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基，在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號(hào)，如順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號(hào)，如HindIIHindII、HindIIIHindIII，HpaIHpaI、HpaIIHpaII，MboIMboI、MboIMboI等。等。 特征和種類特征和種類1 1限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾現(xiàn)象 早在早在 50 50 年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱作寄主年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱作寄主控制的專一性（控制的專一性（host controlled specific

5、ityhost controlled specificity）。）。 l l 噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題（表（表 2-12-1）。）。 l l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。E.coli E.coli 菌株菌株 噬菌體感染率噬菌體感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 說明說明 K K 和和 B B 菌株中

6、存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的 DNA DNA 。 10-10-4 4 的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用。的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用。而在而在 C C 菌株不能限制來自菌株不能限制來自 K K 和和 B B 菌株的菌株的 DNA DNA 。限制作用實(shí)際就是限。限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源制酶降解外源 DNA DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤修飾作用，可使腺嘌呤 A A 成為成為 N6 N6 甲基甲基- -腺膘呤，胞嘧

7、啶腺膘呤，胞嘧啶 C C 成為成為 5 5 甲甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目基胞嘧啶。通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。的。 2. 2.限制與修飾系統(tǒng)的種類限制與修飾系統(tǒng)的種類根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子，限制根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)主要分成三大類。表與修飾系統(tǒng)主要分成三大類。表 2-1 2-1 是各種限制與修飾系統(tǒng)的比較。是各種限制與修飾系統(tǒng)的比較。 型（型（type type ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá)）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá) 93% 93% 。型酶

8、相對(duì)來說最簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近型酶相對(duì)來說最簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割切割 DNA DNA ，產(chǎn)生帶，產(chǎn)生帶 3- 3- 羥基和羥基和 5- 5- 磷酸基團(tuán)的磷酸基團(tuán)的 DNA DNA 產(chǎn)物，需產(chǎn)物，需 Mg2+ Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需 SAM SAM 。識(shí)別序列主要為。識(shí)別序列主要為 4-4-6bp 6bp ，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。簡(jiǎn)并序列，切割位

9、置因酶而異，有些是隔開的。s s 型（型（type type s s）限制與修飾系統(tǒng)，占）限制與修飾系統(tǒng)，占 5% 5% ，與，與 型具有相似型具有相似的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的，長(zhǎng)度為的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的，長(zhǎng)度為 4-7bp 4-7bp ，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的 20bp 20bp 范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。 型限制酶一般是同源二聚體（型限制酶一般是同源二聚體（homodimerhomodimer），由兩個(gè)彼此按相），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單

10、位作用在 DNA DNA 鏈的兩鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。在在 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA DNA 中的中的一條鏈，造成一個(gè)切口，這類限制酶也稱切口酶一條鏈，造成一個(gè)切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzymenicking enzyme），），如如 N.Bst NBI N.Bst NBI 。

11、型（型（type type ）限制與修飾系統(tǒng)的種類很少，只占）限制與修飾系統(tǒng)的種類很少，只占 1% 1% ，能識(shí)別，能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNADNA分子中的分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。如雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。如 EcoK EcoK 和和 EcoBEcoB。其限制酶和甲基化酶。其限制酶和甲基化酶 （即（即 R R 亞基和亞基和 M M 亞基）亞基） 各作為一個(gè)亞基各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA DNA

12、序列的序列的 S S 亞基，分別由亞基，分別由 hsdRhsdR、hsdM hsdM 和和 hsdS hsdS 基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）?；蚓幋a，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。EcoK EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2SR2M2S。 EcoB EcoB 編碼基因的結(jié)構(gòu)為編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M4S2 R2M4S2 。EcoB EcoB 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A A 為甲基化位點(diǎn)，為甲基化位點(diǎn)， N N 表示任意堿基。表示任意堿基。 TGATGA* *（NN）8TGCT 8TGCT EcoK EcoK 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，

13、其中兩條鏈中的酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A A 為可能的甲基化位點(diǎn)。為可能的甲基化位點(diǎn)。 AAAAC C（NN）6GTGC6GTGC但是但是 EcoB EcoB 酶和酶和 EcoK EcoK 酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 1000bp 1000bp 以外，以外，且無特異性。且無特異性。 型（型（type type ）限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到）限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到 1% 1% ，也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核

14、苷酸對(duì)則是任意的，如核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的，如 EcoP1 EcoP1 和和 EcoP15 EcoP15 。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC AGACC 和和 CAGCAG CAGCAG ，切割位點(diǎn)則在下游切割位點(diǎn)則在下游 24-26bp 24-26bp 處。處。在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 型型系統(tǒng)中的種類。系統(tǒng)中的種類。 表表2-12-1：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較酶分子酶分子內(nèi)切酶與甲基化內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起酶分子不在一起

15、三亞基雙功能酶三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)4-6bp, 4-6bp, 大多數(shù)大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)二分非對(duì)稱二分非對(duì)稱5-7bp 5-7bp 非對(duì)稱非對(duì)稱切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中或在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)靠近識(shí)別位點(diǎn)無特異性，至少無特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp1000bp在識(shí)別位點(diǎn)下游在識(shí)別位點(diǎn)下游 24-26bp24-26bp限制反應(yīng)與甲基限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)化反應(yīng)分開的反應(yīng)分開的反應(yīng)互斥互斥同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)限制作用是否需限制作用是否需用用 ATPATPNoNoYesYesYesYes限制酶識(shí)別的序列 1限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)

16、度限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 4-8 個(gè)堿基，最常見的為 6 個(gè)堿基（表2-2）。當(dāng)識(shí)別序列為 4 個(gè)和 6 個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每 256 個(gè)和 4096 個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44=256，46=4096）。以下是幾個(gè)有代表性的種類，箭頭指切割位置。 4 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3A GATC5 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoR CCWGG；Nci CCSGG6 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoR GAATTC； Hind AAGCTT7 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：BbvC CCTCAGC； PpuM RGGWCCY8 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNN

17、NNGGCC以上序列中部 分字母代表的堿基如下。R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 CK=G 或 T S=C 或 G W=A 或 TH=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T2限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在 DNA 兩條鏈相對(duì)稱的位置。 EcoR 和 Hind 的識(shí)別序列和切割位置如下： EcoR GAATTC；Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA有一些限制酶的識(shí)別序列不是對(duì)稱的，如 AccBSCCGCTC（-3/-3） 和 BssSCTCGTG（-5

18、/-1）。識(shí)別序列后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置。AccBS CCGCTC；BssS CTCGTG GGCGAG GAGCAC有一些限制酶可識(shí)別多種序列，如 Acc 識(shí)別的序列是 GTMKAC ，也就是說可識(shí)別 4 種序列，其中兩種是對(duì)稱的，另兩種是非對(duì)稱的。 Hind 識(shí)別的序列是 GTYRAC 。有一些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。如 AlwN 和 Dde ，它們的識(shí)別序列如下：AlwN CAGNNNCTG；Dde CTNAG GTCNNNGAC GANTC 3限制酶切割的位置限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩

19、端、兩側(cè)和單側(cè)之別。切點(diǎn)在兩端的有 Sau3A（GATC）、Nla（CATG）和 EcoR（CCWGG） 等；在兩側(cè)的有 Bcg（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）和 TspR（CASTGNN）， Bcg 酶的切割特性與其它酶不同，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)的兩端各切開一個(gè)斷點(diǎn)，而不是只產(chǎn)生一個(gè)斷點(diǎn)。切點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)的還有 BbvGCAGC（8/12） 和 BspMACCTGC（4/8） 等。Bcg 10（N）CGA（N）6TGC（N）12； 12（N）CGA（N）6ACG（N）10 TspR NNCAC（G）TGNN NNGTG（C）ACNN 1限制酶產(chǎn)生匹配粘端（Matched end）

20、識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。若在對(duì)稱軸 5 側(cè)切割底物，DNA 雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生 5 突出粘性末端，如 EcoR ；若在 3 側(cè)切割，則產(chǎn)生 3 突出粘性末端，如 Kpn 。 EcoR NNGAATTCNN NNCTTAAGNN2限制酶產(chǎn)生平末端（Blunt end） 在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如 Hae（GGCC），Sma（CCCGGG），EcoRV（GATATC）。產(chǎn)生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。限制酶產(chǎn)生的末端 3

21、限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端許多限制酶切割 DNA 產(chǎn)生非對(duì)稱突出端。當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的，如 BbvC，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下：CCTCAGCGGAGTCG有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列，其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的。如 Acc，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對(duì)稱：GTAT/CGACCATA/GCTG有些限制酶識(shí)別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如 Dra 和 Ear，它們的識(shí)別切割位點(diǎn)分別是 CACNNNGTG 和 CTCTTC （1/4）。 4同裂酶（isoschizomer） 識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可

22、能不同。具體可分為以下幾種情況。 同序同切酶 這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同，如 Hind 與 Hinc 識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTYRAC ， Hpa 與 Hap 識(shí)別切割位點(diǎn)為 CCGG ， Mob 與 Sau3A 識(shí)別切割位點(diǎn)為 GATC 。 同序異切酶 Kpn 和 Acc65 識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同，分別為 GGTACC 和 GGTACC 。另外， Asp718 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 GGTACC 。 “同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如 EcoR 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 GAATTC ， Apo 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 RAATTY ，后者可識(shí)別前者的序列。另

23、外， Hpa 和 Hinc 的識(shí)別位點(diǎn)也有交叉，它們的識(shí)別和切割位點(diǎn)分別為 GTTAAC 和 Hinc 。 其它有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在 pUC 系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè) Sal 位點(diǎn)（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTCGAC），該位點(diǎn)也可被 Acc（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTMKAC）和 Hinc（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTYRAC）切割。5同尾酶 許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。以下幾種酶產(chǎn)生的末端是相同的。通過表 4-3 很容易判斷哪些酶可產(chǎn)生相同的 DNA 末端。 Eco

24、R GAATCC Mfe CAATTC Apo RAATTY Spe ACTAGT Nhe GCTAGC Xba TCTAGA BamH GGATCC Sau3A GATC Sty CCWWGG Cla ATCGAT Acc GTMKAC （pUC19）6識(shí)別特殊系列的 -prefix 和 p-prefix 系列酶 有些線粒體、葉綠體、核 DNA 、T 偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些 intein （protein splicing element） 也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為 -prefix 和 p-prefix 系列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。 -prefix 是由

25、在 RNA 水平上剪切和編碼的， p-prefix 在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。這類內(nèi)切酶也稱為 homing endonuclease ，目前商業(yè)化的種類有 6 種。從因特網(wǎng)上可以找到 Intein 的數(shù)據(jù)庫(kù) Inbase（Intein Database），該網(wǎng)站由 New England BioLabs 公司維護(hù)（http:/） 。 -CeuI 酶是衣滴蟲（Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識(shí)別位點(diǎn)為 26bp ，識(shí)別的核心部位為 -12 至 +7 位置的 19bp 。反應(yīng)溫度為 37 ，識(shí)別位點(diǎn)如下，方框內(nèi)為核心識(shí)別序列。 TAAC

26、TATAACGGTCCTAAGGCADNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響 限制酶切割限制酶切割 DNA DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。割活性。用用 20 20 單位（單位（UnitsUnits）限制酶切割）限制酶切割 1 1 g g 標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求（表現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要

27、求（表 2-32-3）。相對(duì)來說，）。相對(duì)來說， EcoEcoR R 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)在在 2 2 小時(shí)的切割活性可達(dá)小時(shí)的切割活性可達(dá) 90% 90% 。而。而 AccAcc 和和 HinHind d 對(duì)兩端的序列對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較大。長(zhǎng)度要求較大。 用用 DNA DNA 片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。求是不同。在設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì) PCR PCR 引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的順利切割擴(kuò)增的 PCR PCR 產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。 表表2-32-3：靠近：靠近DNADNA片段末端的切割效率片段末端的切割效率%（用寡核苷