分子生物學基礎(chǔ)知識

1、前 言中心法則：第一章 PCR一、概念： PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。二、原理： DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生

2、變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至60左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)

3、合物在72、DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對原則與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。三、引物 PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5引物和3引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5端引物與位于待擴增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段3端的一小段DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則引物長度：15-30bp

4、，常用為20bp左右，Tm值在60比較好。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。常用引物設(shè)計軟件有：Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit、DNAstar等Tm值： Tm值就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。Tm計算公式為：Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)四、示意過程：例如：Taq Plus DNA Polymerase(P201)反應(yīng)體系：DDWTo 20lTaq DNA Polymerase

5、(5 U/l)1U-2U10 × Taq Plus Buffer(with 15mM MgCl2)2l25mM MgCl2optionaldNTP Mix (10 mM each)0.4l引物F (10 M)0.8l引物R (10 M)0.8l模板DNA根據(jù)說明書提供的參考濃度選擇反應(yīng)程序：955 min (預變性)9530 sec30-35循環(huán)6030 sec7260 sec/kb727 min (徹底延伸)附：DNA與RNA的區(qū)別？1、組成單位不同：DNA的組成單位是脫氧核苷酸，RNA的組成單位是核糖核苷酸，2、組成堿基不同：DNA的組成堿基是ATGC，RNA的組成堿基是AUGC

6、3、組成五碳糖不同：DNA的組成五碳糖是脫氧核糖，RNA的組成五碳糖是核糖，4、空間結(jié)構(gòu)不同：DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，RNA一般是單鏈。5、功能不同：DNA是遺傳物質(zhì)，RNA一般在細胞中不作為遺傳物質(zhì)。第二章 逆轉(zhuǎn)錄一、概念： 逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)是以RNA為模板合成DNA的過程。以DNA為模板合成RNA的過程叫做轉(zhuǎn)錄，此過程與該流動方向（DNA到RNA）相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。二、原理： 人們通過體外模擬該過程，以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的

7、基因的策略之一。三、mRNA： Messenger RNA (mRNA）又叫做信使RNA，是一類在蛋白質(zhì)合成時充當模板的RNA。信使RNA是脫氧核糖核酸（DNA）轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈RNA。它在核糖體上作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定肽鏈的氨基酸排列順序。mRNA存在于原核生物和真核生物的細胞質(zhì)及真核細胞的某些細胞器（如線粒體和葉綠體）中。 在真核生物中，最初轉(zhuǎn)錄生成的RNA稱為核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），然而在細胞漿中起作用，作為蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成模板的是mRNA（messenger RNA）。hnRNA是mRNA的未成熟前體。

8、兩者之間的差別主要有兩點：一是hnRNA核苷酸鏈中的一些片段將不出現(xiàn)于相應(yīng)的mRNA中，這些片段稱為內(nèi)含子（intron），而那些保留于mRNA中的片段稱為外顯子（exon）。也就是說，hnRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過程中經(jīng)過剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新連接在一起；二是mRNA的5末端被加上一個m7pGppp帽子，在mRNA3末端多了一個多聚腺苷酸（polyA）尾巴。 mRNA的核苷酸序列與DNA序列相應(yīng)，決定著合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。三個核苷酸組成一個密碼子，每個密碼子由三個前后相聯(lián)的核苷酸組成，一個密碼子只為一種氨基酸編碼。共有64個密碼子。四、示意過程反應(yīng)體系：DEPC水To

9、20l5×RT buffer4ldNTP Mix (10 mM each)1lOligo dT（50m）/N61lRNase inhibitor （40U/l）1lReverse Transcriptase （200U/l）1lRNA模板1ng-1g反應(yīng)程序：逆轉(zhuǎn)錄5045min逆轉(zhuǎn)錄酶失活855min附：逆轉(zhuǎn)錄實驗的注意事項：1、RNA容易降解。RNase A酶非常穩(wěn)定，是導致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后又迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生

10、物學實驗時，必須戴手套。2、用TRIZOL或RNA提取試劑盒提取的總RNA，包括信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和核糖體 RNA(rRNA)。其中核糖體RNA(rRNA)占總RNA的80-85%，信使RNA(mRNA)只占1-2%。 第三章 熒光定量PCR一、概念： 是指在PCR反應(yīng)體系中加入能夠指示DNA片段擴增過程的熒光染料(SYBR Green等)或熒光標記的特異性的探針(TaqMan Probe等)，通過對PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，再結(jié)合相應(yīng)的計算機軟件對所獲得的熒光信號數(shù)據(jù)進行分析，計算待測樣品特定DNA片段的初始濃度。二、信號產(chǎn)生原理三、重

11、要概念1、熒光基線：指PCR循環(huán)起始時，雖然熒光信號積累，但仍在儀器可以檢測的靈敏度下，接近一條直線。2、熒光閾值：等于3-18個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，處于PCR擴增的指數(shù)期，一般儀器會自動給出一個熒光閾值，也可人為調(diào)節(jié)。3、Ct值：指熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4、內(nèi)參基因：又叫管家基因，是細胞中持續(xù)、恒量轉(zhuǎn)錄表達的基因，每個細胞中管家基因的轉(zhuǎn)錄水平相差很小，且始終和待測靶序列經(jīng)過相同的處理過程，因而可以校正各個操作環(huán)節(jié)如組織樣本的多少、RNA提取過程的得率及完整度、逆轉(zhuǎn)錄效率、RNA定量過程產(chǎn)生的誤差，將靶基因歸一化到相同細胞數(shù)比較。常用的內(nèi)參基因有GAPDH、

12、-Actin、-Tubulin等。四、分類目前常用的定量方法有兩種：絕對定量和相對定量。兩者的區(qū)別在于制作標準曲線的標準品的靶基因拷貝數(shù)是否已知。1、絕對定量：DNA標準品的拷貝數(shù)是已知的，可以根據(jù)標準曲線和待測樣本的Ct值，計算出待測樣本靶序列的拷貝數(shù)。2、相對定量：DNA標準品的拷貝數(shù)是未知的，只已知稀釋倍數(shù)，可以根據(jù)各待測樣本和相應(yīng)內(nèi)參基因的Ct值，計算出待測樣本靶序列的拷貝數(shù)之間相差的倍數(shù)。第四章 克隆和點突變一、傳統(tǒng)克隆概念： 一般意義上，在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的方法導進宿主細胞，進行重組、篩選、擴增的過

13、程。二、實驗流程：1）線性化載體的制備2）插入片段PCR擴增3）進行重組反應(yīng)4）反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板 可概括為切、連、轉(zhuǎn)、選。 "切"是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；"連"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉(zhuǎn)"是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復制和擴增；"選"則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。附：基本概念1、質(zhì)粒載體： 質(zhì)粒是獨立于細菌染色體外自我復制的遺傳因子，在基因工程中作為最常用，最簡單的載體，一般包括

14、三部分：遺傳標記基因（抗生素抗性基因），復制區(qū)，多酶位點區(qū)域。天然的質(zhì)粒都是環(huán)狀雙鏈DNA，大小從幾個到數(shù)百個kb。2、限制性核酸內(nèi)切酶： 限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，簡稱限制酶。 限制性內(nèi)切酶識別DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位點在回文的一側(cè)（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal 、HPa I、Sma I等，切割位點在回文序列中間，形成平整末端。3、 點突變 是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒

15、）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。通俗的說，通過設(shè)計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點變過來了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。第五章 細胞生物學一、細胞凋亡： 細胞凋亡（apoptosis）指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。人體內(nèi)的細胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關(guān)細胞死亡過程的研究，已成為生物學、醫(yī)學研究的一個熱點。

16、因此，細胞凋亡的檢測是實驗研究過程中的重要手段。 用于早期凋亡：Annexin V Apoptosis Detection Kit 在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為3536 kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行綠色熒光 (FITC或EGFP)標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯

17、微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。 用于晚期凋亡：TUNEL Apoptosis Detection Kit 細胞凋亡晚期的一個顯著特點是細胞染色體的DNA被內(nèi)源核酸內(nèi)切酶有規(guī)律的降解成長度約為180-200 bp的整倍數(shù)的片段。TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)法應(yīng)用末端脫氧核糖

18、核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞的斷裂DNA的3´-OH末端催化摻入熒光分子標記的dUTP，使得凋亡細胞可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。二、細胞增殖周期： 細胞分裂具有周期性，即連續(xù)分裂的細胞，從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，為一個細胞周期。一個細胞周期細分為以下幾個階段： G0期：分裂停止期，具有分裂能力的細胞在反復分裂數(shù)次之后，處于停止分裂狀態(tài)的時期； G1期：DNA合成準備期，開始合成細胞生長需要的各種蛋白質(zhì)，糖類，脂類、RNA等生化物質(zhì)，細胞DNA總量不變，主要為S期做準備； S期：DNA合成期，此階段DNA數(shù)目加倍； G2期：分裂準備期，DNA合成已經(jīng)終止，但是蛋白質(zhì)、RNA等仍在合成，主要為M期做準備； M期：分裂期，細胞開始分裂，一分為二，分裂結(jié)束后，再次進入G0期，循環(huán)分裂過程。三、細胞轉(zhuǎn)染： 轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學介導方法很多，如經(jīng)典的