寄生蟲試驗診斷方法

1、1臨床診斷：A病史、癥狀、體征 B物理診斷：X線、B超、C不MRI2實驗室檢查：A病原學(xué)方法：糞便檢查；血液檢查；排泄物分泌物檢查；其他器官組織檢查B免疫學(xué)方法 C分子生物學(xué)方法（一）糞便檢查：直接涂片法；厚涂片法；濃集法；毛蚓孵化法；肛門拭子檢查法；鉤鮑培養(yǎng)法；蟲卵計 數(shù)法；定量透明法；帶絳蟲孕節(jié)檢查法。糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準確的結(jié)果1）糞便必須新鮮，送檢時間一般不宜超過24小時； 2 ）盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；3）糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結(jié)果；4）取材部位：盡可能取病變部位。直接涂片法：用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡便，適用范圍廣，但檢

2、出率相對較低。一般要 求連續(xù)作3次涂片，可提高檢出率。（1）蠕蟲卵檢查：方法：一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應(yīng)注意蟲卵與糞便中異物的鑒 別。蟲卵都具有一定形狀和大??；卵殼表面光滑整齊，具固有色澤；卵內(nèi)含卵細胞或幼蟲。原蟲檢查：1）活滋養(yǎng)體檢查：方法同查蠕蟲卵。注意事項。2 ）包囊的碘液染色檢查：方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。若同時需檢查活滋養(yǎng)體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，再蓋上蓋 片。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養(yǎng)體。3）隱抱子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺酚改良抗酸染色法。對于新鮮糞便或經(jīng)10%福爾馬林固定保存的含卵囊糞便都可用此法染色。染

3、色過程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法復(fù)染。厚涂片透明法（改良加藤法）取名5mg糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油-孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20X 25mm。待糞膜稍干，即可鏡檢。玻璃紙準備：將玻璃紙浸于甘油-孔雀綠溶液中， 至少浸泡24小時，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時間。如糞膜厚，透明時 間短，蟲卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時間過長，則蟲卵變形，也不易辨認。沉淀法：原蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。方法：自然沉淀法；離心沉淀法；醛酸沉淀法；自然沉淀法：取糞便2030g、加水成混懸液，經(jīng)金

4、屬篩過濾，再加清水沖洗殘渣；過濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔1520分鐘換水一次（34次），直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（15002000rpm/min） 12分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀 34次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。醛酸沉淀法：置糞便12g加水1020ml調(diào)勻，將糞便混懸液過濾，離心（2000rpm） 2分鐘；倒去上層 糞液，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10%甲醛7ml。5分鐘后加乙醛3ml,塞緊管口并充分 搖勻，取下管口塞，離心 2分鐘，即可見

5、管內(nèi)自下而上分為 4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊， 可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。浮聚法：利用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有三種：1.飽和鹽水浮聚法；2.硫酸鋅離心浮聚法；3.蔗糖離心浮聚法飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。方法、優(yōu)缺點、適用范圍。飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動，直至食鹽不再溶解為止硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g,加水充分攪碎，按離心沉淀法過濾，反復(fù)離心34次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重的硫酸鋅液 （33%的溶液）， 調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至

6、距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱抱子蟲的卵囊。取糞便約加水并過濾。取濾液離心510分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無色，隱抱子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時后卵囊脫水變形不易辨認，故應(yīng)立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。毛鮑孵化法 取糞便約30g,先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶內(nèi)，加清水（去氯水）至 瓶口，在2030c的條件下經(jīng)46小時后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。，如見水面下有白色點狀物作

7、直線來往 游動，即是毛蝴。肛門拭子檢查法適用于在肛周產(chǎn)卵（燒蟲），或常在肛門附近發(fā)現(xiàn)蟲卵（牛帶絳蟲）的蟲卵檢查法。棉簽拭子法：用浸泡生理鹽水的棉簽，在肛門周圍擦拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動，迅速提起棉簽并棄去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一載玻片，5分鐘后取載玻片鏡檢。也可將擦拭肛周的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。透明膠紙法：用長約6cm,寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上， 鏡檢。鉤鮑培養(yǎng)法：根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時間內(nèi)孵出幼蟲的原理設(shè)計的方法。蟲卵計數(shù)法：蟲卵計數(shù)

8、用于估計人體內(nèi)寄生蟲的感染度，常用司徒爾（ Stoll ）氏法，即司氏稀釋蟲卵計數(shù) 法定量透明法 適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲卵的檢查及計數(shù)。方法：將所得蟲卵數(shù)X 24,再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)（eggs per gram, EPG。（二）血清檢查：是診斷瘧疾、絲蟲病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，自來水、蒸儲水沖洗，在 95%酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。厚薄血膜同片制作：檢查瘧原蟲。操作步驟、優(yōu)缺點檢查微絲蝴新鮮血片檢查：晚間 9時至次晨2時取血1滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形 游動的幼蟲后，仍須作染色檢查，以確定蟲種。厚血膜檢查：厚血膜的制作、

9、溶血、固定與姬氏液染色同瘧原蟲。但需取血3滴，也可用蘇木素染色法染色。（三）排泄物與分泌物等的檢查痰液 痰中可能查見肺吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蝴的原頭蝴、糞類圓線蟲幼蟲、蛔蝴、鉤蝴、塵螭等；卡氏肺抱子蟲的包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。肺吸蟲卵檢查：直接涂片法；濃集法直接涂片法：在潔凈載玻片上先加12滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加 蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲卵，但見有夏科-雷登晶體，提示可能是肺吸蟲患者。濃集法：收集24小時痰液，置于玻璃杯中，加入等量10%NaOH§液，使痰液消化成稀液狀。以 1500rpm離心510分鐘，棄去上清液，取沉渣滴涂

10、片檢查。溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體檢查 ：取新鮮痰液作涂片。天冷時應(yīng)注意鏡臺載玻片保溫。高倍鏡觀察。如為阿 米巴滋養(yǎng)體，可見其伸出偽足并作定向運動。十二指腸液和膽汁用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直接涂片法鏡檢；也可經(jīng)離心濃集后，吸取沉渣鏡檢?？蓹z查藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲卵、肝片形吸血卵和布氏姜片蟲卵等；急性阿米巴肝膿腫患者偶在膽汁中發(fā)現(xiàn)大滋養(yǎng)體。尿一般先離心，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙酸，用力振蕩，使脂肪溶于乙醛。然后吸去脂肪層， 離心，取沉渣鏡檢。鞘膜積液 主要檢查班氏微絲蜘。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也 可加適量生理鹽水稀釋離心，取沉

11、渣鏡檢。陰道分泌物 檢查陰道毛滴蟲其它器官組織檢查1.骨髓穿刺 主要檢查杜氏利什曼原蟲無鞭毛體。一般常作骼骨穿刺，取少許骨髓液作涂片；甲醇固定， 同薄血膜染色法染色，油鏡檢淋巴結(jié)穿刺利什曼原蟲：檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡便、安全，且有一定療效考核價值。淋巴結(jié)組織液注于載 玻片上，作涂片染色檢查。也可用摘除的淋巴結(jié)的切面做涂片，染色后鏡檢。絲蟲成蟲：可用注射器從可疑的淋巴結(jié)節(jié)中抽取成蟲，或剖檢摘除的結(jié)節(jié)尋找成蟲，也可作病理組織切 片檢查。肌肉活檢旋毛蟲幼蟲從患者的腓腸肌或肱或股二頭肌取米粒大小的肌肉一塊，置于載玻片上，加50%甘油滴，蓋上另一載玻片，均勻用力壓緊，低倍鏡下觀察。取下肌肉須立即檢

12、查，否則幼蟲變得模糊，不易檢查。豬囊尾蜘 摘取肌肉內(nèi)的結(jié)節(jié)，剝除外層纖維被膜，在 2張載玻片間壓平、鏡檢。也可經(jīng)組織固定后作 切片染色檢查。皮膚：檢查疥螭，蠕形螭，利什曼原蟲等。疥螭：蠕形螭：利什曼原蟲：直腸粘膜：用直腸鏡從直腸粘膜病變組織內(nèi)可查見日本血吸蟲卵及溶組織阿米巴滋養(yǎng)體。日本血吸蟲卵：用直腸鏡自直腸取米粒大小的粘膜一塊，經(jīng)水洗后，放在 2載玻片間，輕輕壓平，鏡檢 溶組織阿米巴：用乙狀結(jié)腸鏡觀察潰瘍形狀，自潰瘍邊緣或深層刮取潰瘍組織，置于載玻片上，加少量生 理鹽水，蓋上蓋片，輕輕壓平，立即鏡檢。也可取出一小塊病變的粘膜組織，固定切片，染色檢查。免疫學(xué)診斷環(huán)卵沉淀試驗（COPT是以血吸蟲

13、整卵為抗原的特異免疫血清學(xué)試驗原理：卵內(nèi)毛螃或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍 形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強度并計數(shù)反應(yīng)卵的百分率稱環(huán)沉率。方法：塑料管法COPT:雙面膠紙法COPT: PVF抗原膜片法：血凝板法：組織內(nèi)環(huán)卵沉淀反應(yīng)： 酶聯(lián)環(huán)卵沉淀反應(yīng)方法評價：COPTH乍為診斷血吸蟲病的血清學(xué)方法之一，及臨床治療病人的依據(jù)；可用作考核治療和防治 效果的方法；并且用于血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測疫情的方法。皮內(nèi)試驗：利用宿主的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，將特異抗原液注入皮內(nèi)，觀測皮丘及紅暈反應(yīng)以判斷有無特異抗 體（IgE）的存在稱皮內(nèi)試驗（IDT）。方法：

14、取皮試液作皮內(nèi)注射，20min后判斷皮試結(jié)果。結(jié)果判斷標準： 陰性：局部無紅腫、無異常全身反應(yīng)。陽性：皮丘紅腫，硬結(jié)直徑大于，紅暈范圍直徑超過4cm,有時出現(xiàn)偽足或有癢感.皮內(nèi)試驗用于多種寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病等。最常用于血吸蟲病的調(diào)查。操作簡單，并且可即時觀察結(jié)果，適宜現(xiàn)場應(yīng)用。大多用粗制可溶性血吸蟲蟲卵抗原（稀釋度為1 : 4000）或成蟲冷浸抗原（稀釋度為1: 8000）,其陽性率在93%97%,但有部分假陽性反應(yīng)（）,并且對其他寄生蟲 病交叉反應(yīng)較高。皮內(nèi)試驗的應(yīng)用范圍：過篩方法，先作皮試，陽性者再作進一步追查；臨床輔助診斷；考核預(yù)防效 果，用作檢查新感染的方法，特別對兒

15、童。染色試驗（DT）是比較獨特的免疫反應(yīng)，是目前診斷弓形蟲病較好的方法，可用于該病的臨床診斷和流行 病學(xué)調(diào)查原理：新鮮活弓形蟲滋養(yǎng)體胞質(zhì)對堿性美藍有很強的親和性，能被染成藍色；但當弓形蟲受特異性抗體和 輔助因子協(xié)同作用后，細胞變性、細胞膜破裂，細胞質(zhì)外溢，蟲體不著色。新鮮弓形蟲滋養(yǎng)體和正常血清 混合，在37c作用1小時或室溫數(shù)小時后，大部分弓形蟲失去原來的新月形，而變?yōu)閳A形或橢圓形，用堿 性美藍染色時著色很深。但新鮮弓形蟲和免疫血清混合時，蟲體仍保持原有形態(tài)，用堿性美藍染色時，著 色很淺或不著色。其原因可能是由于弓形蟲受到特異體抗體和輔助因子協(xié)同作用后，蟲體細胞變性，結(jié)果 蟲體對堿性美藍不易著

16、色。方法：將經(jīng)56度30min滅活的待測血清同滋養(yǎng)體和輔助因子共同作用后加美藍染色，如有50僦以上不著色者即為陽性。可使 50%蟲體不著色的血清稀釋度即為血清陽性滴度。結(jié)果判斷：1 : 8為隱性感染；1 : 256為活動性感染；1 : 1024為急性感染。間接血凝試驗（IHA）原理：以人O型紅細胞或綿羊紅細胞為載體，經(jīng)特殊處理后結(jié)合上特異性抗原，即為致敏紅細胞。在遇到 相應(yīng)的抗體時發(fā)生特異性結(jié)合，致使紅細胞產(chǎn)生交聯(lián)而凝集成肉眼可見的團塊，即為陽性。如無特異性的 抗體則紅細胞不發(fā)生凝集而沉于底部，為陰性。間接血凝抑制試驗：用已知抗原或抗體預(yù)先與待測標本作用，以中和相應(yīng)的抗體或抗原，再加入相應(yīng)的致

17、 敏紅細胞，如無法交聯(lián)而不發(fā)生凝集則為陽性。根據(jù)紅細胞在孔底的沉積類型而定?！耙弧保t細胞沉于管底，呈圓點形，外周光滑；“土”，紅細胞沉于管底，周圍不光滑或中心有白色小點；“十”，紅細胞沉積范圍很小，呈較明顯的環(huán)形圈“十十”，紅細胞沉積范圍較小，其中可出現(xiàn)淡淡的環(huán)形圈；“十十十”，紅細胞布滿管底呈毛玻璃狀；“十十十十”，紅細胞呈片狀凝集或邊緣卷曲。呈明顯陽性反應(yīng)（十）的最高稀釋度為該血清的滴度或效 價。間接熒光抗體法（IFA）原理：將抗原與未標記的特異性抗體（如患者血清）結(jié)合，然后使之與熒光標記的抗免疫球蛋白抗體（抗 抗體）結(jié)合，三者的復(fù)合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點是制備一種熒光標記的抗體，可以

18、用于多種抗原，抗 體系統(tǒng)的檢查，即可用以測定抗原，也可用來測定抗體。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經(jīng)充分干燥后低溫長期保存?zhèn)溆?。一張載片可等距置放多個抗原位點用以同時檢測多個樣本或確定滴度。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）簡稱酶聯(lián)試驗，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液以及排泄分泌物（尿， 乳，糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測。根據(jù)檢測要求，試驗可分多種類型，常用者有：用于檢測抗 體的間接法；檢測IgM的雙夾心法；檢測抗原的雙抗體夾心法；以固相抗體檢測抗原的競爭法以及競爭抑 制法等。酶聯(lián)試驗的方法根據(jù)所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應(yīng)結(jié)果等不同而有很大差別。目前最常用的 固相載體為

19、聚苯乙稀微量滴定板，具有需樣少，敏感，重演性好，使用方便等優(yōu)點。酶底物系統(tǒng)也有多種， 常用的有辣根過氧化物酶鄰苯二胺（HRP-OPD、堿性磷酸酯酶硝酚磷酸鹽 （AKPPNP等，具有較好的生物放大效應(yīng)。其中HRP由于價廉、易得而被廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)試驗的基本操作過程可分為：固相包被；溫育洗滌；加樣；酶結(jié)合物反應(yīng)；底物顯色； 終止反應(yīng)讀取結(jié)果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間，用以去除多余的反應(yīng)物。斑點ELISA （ dot-ELISA ）是近年新發(fā)展的一種 ELISA技術(shù)，選用對蛋白質(zhì)有很強吸附能力的硝酸纖維素薄 膜作固相載體，底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色，然后目測或用光密度掃描儀定量。dot-ELISA可用來檢測抗體，也可用來檢測抗原，由于該法檢測抗原時操作較其他免疫學(xué)試驗簡便，故目 前多用于抗原檢測。免疫印漬試驗 是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝