重組蛋白純化概述

1、重組蛋白純化概述蛋白的分離純化是生物工程下游階段一個比較重要的部分，尤其在基因工程重組蛋白的分離純化中，上游過程的許多因素會直接影響到下游蛋白的分離，充分利用上游對下游的影響，對蛋白的純化做一個全面的考慮和整體的設(shè)計(jì)。是否帶有親和標(biāo)簽，His標(biāo)簽，GST標(biāo)簽等，不同的親和標(biāo)簽選擇不同的純化方案；可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通?；钚缘鞍椎牡寐时容^低；是否對宿主細(xì)胞具有毒性，從而選擇抗毒性的表達(dá)系統(tǒng)；怎樣選擇表達(dá)系統(tǒng)，是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)還是CHO

2、細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)；蛋白的化學(xué)性質(zhì)，是否容易被蛋白酶降解，是否會和一些金屬離子，化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)；蛋白的物理性質(zhì)，是否對溫度敏感等。從蛋白基因的獲取，蛋白基因的克隆，蛋白的表達(dá)，做好一個整體的規(guī)劃，將對純化工作的方便快捷高效帶來關(guān)鍵的影響?；蚬こ虡?gòu)建的純化標(biāo)記有很多，通過改變cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸，這個加入的標(biāo)記可用來作為一個有效的純化依據(jù)。GST!蟲合載體，蛋白A融合載體，含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged

3、）等, 不同親和標(biāo)簽的蛋白有不同的純化方案。一含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged ）重組蛋白的純化（一）選擇親和標(biāo)簽時需要考慮的因素親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對標(biāo)簽與其配體親和作用的影響，以及實(shí)際的用途。（ 1） 親和標(biāo)簽是否會影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，大多數(shù)情況首選短的多肽標(biāo)簽，這是因?yàn)槎痰碾臉?biāo)簽對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小，而大的親和標(biāo)簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。（ 2） 親和標(biāo)簽對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，親和標(biāo)簽的加入是否會影響到目標(biāo)蛋白的真確折疊，是促進(jìn)目標(biāo)蛋白的可溶性，還是容易形成包

4、涵體，會不會造成氨基酸C和N段地破壞，使目 的蛋白表達(dá)不完全。（3）親和標(biāo)簽所融合的位置，親和標(biāo)簽可以加在 N端，可以 加在C端，也進(jìn)行串聯(lián)。多數(shù)情況下蛋白質(zhì)的N端區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能不是太重 要，所以在N 端進(jìn)行融合標(biāo)簽的融合常常能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。由于N端DNAff列對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯影響較大，所以標(biāo)簽加在N端對蛋白質(zhì)的表達(dá)水 平影響更大，優(yōu)化標(biāo)簽的 mRN船構(gòu)可使表達(dá)水平提高?？赡苡行┑鞍准兓笮?要去除親和標(biāo)簽C端融合在去除融合標(biāo)簽后在目標(biāo)蛋白的 C端會有幾個氨基酸殘 留， 而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N 端親和標(biāo)簽后得到天然的目標(biāo)蛋白。（4）親和洗脫的條件，有些

5、條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該不使目標(biāo)蛋白變性。（二）含組氨酸蛋白純化的依據(jù)蛋白質(zhì)表面的組氨酸與多種過渡金屬離子如Cu2+， Zn2+， Ni 2+， Co2+， Fe3+形成配位相互作用，從而能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。 因此， 固定有這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地純化這類含有多個組氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸與固定金屬離子結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基，對純化影響不大。螯合物的穩(wěn)定性受單個組氨酸和半胱氨酸解離常數(shù)所控制，從而亦受流動相的p書口溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離。蛋白樣品的預(yù)處理1 誘導(dǎo)方式 :

6、 誘導(dǎo)方式的選擇上，為了得到真確折疊的目的蛋白，表達(dá)菌種的生長情況，菌種是否健壯，是否是單克隆菌種，菌體的濃度是否適合誘導(dǎo)，生長狀態(tài)不好的表達(dá)菌，一方面會造成目的蛋白的錯誤折疊，造成蛋白大小，形態(tài)等發(fā)生改變，另一方面會因?yàn)镮PTG的加入，導(dǎo)致菌體的死亡或者降解。低溫度誘導(dǎo)有助于蛋白二硫鍵的正確折疊，但對于高溫表達(dá)的蛋白不適合低溫狀態(tài)，溫度過高容易導(dǎo)致包涵體的形成。誘導(dǎo)劑：基因的誘導(dǎo)表達(dá)基于乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制，沒有乳糖存在的時候，阻礙物基因產(chǎn)生阻礙蛋白，阻礙蛋白和操縱子結(jié)合，抑制基因的表達(dá)；當(dāng)有乳糖存在的時候，B-半乳糖甘酶和乳糖作用產(chǎn)生異半乳糖，異半乳糖和阻礙蛋白結(jié)合，解除抑制，激活基因，開始

7、表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)的濃度的高低對目的蛋白的表達(dá)也會有產(chǎn)生影響。BL21（ DE3） , Rosetta（DE3） 等大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)這些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3 DE犯的一種衍生 減菌體，帶有噬菌體21抗性 區(qū)和lacI基因，lacUV*動子，以及T7 RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int 基因，因此阻止了 DE*E沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一 且形成DE籀原狀態(tài)，就只有受IPTG誘導(dǎo)的lac UV明動子指導(dǎo)T7 RNA5合酶基因 轉(zhuǎn)錄，在溶原培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導(dǎo)T7 RNA1合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA 開始轉(zhuǎn)錄。3. 抽提方式：進(jìn)行破壁之前應(yīng)該選

8、擇合適的緩沖組分，合適的 pH 要結(jié)合酸堿溶液的滴定調(diào)節(jié)，盡量低的離子強(qiáng)度，加入一些穩(wěn)定成分穩(wěn)定成分，EDTAI合重金屬離子，Triton X-100 , NP4第表面活性劑，保護(hù)非極性表面等。4. 確定蛋白質(zhì)樣品的形態(tài)，濃度 黏度 體積。 有時候得到粗蛋白的時候，會觀是否符合目的蛋白的一些性質(zhì)，確保得到是目標(biāo)蛋白。粗蛋白的形態(tài)有沒有明顯的差異，濃度是否符合純化的要求，是否有較多的干擾物質(zhì)，核酸 色素 強(qiáng)結(jié)合成分。5. 優(yōu)化表達(dá)條件6. 1）重組蛋白不表達(dá)或者表達(dá)量低。如果重組蛋白不表達(dá)（包含體和可溶蛋白都沒有）通過改變誘導(dǎo)劑濃度，誘導(dǎo)溫度，時間等都不表達(dá)的時候，然后嘗試更換菌株、質(zhì)粒載體。降

9、低誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度。重組蛋白表達(dá)得越慢，其折疊效果就越好，大腸桿菌在 4時依然可以表達(dá)重組蛋白，而將培養(yǎng)溫度降低至25-30就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)；減少誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑濃度可以降低至1/10;選用Lac滲透酶缺陷型菌株，如 Tuner、 Rosetta 等， 也有很好的效果。這類菌株能夠使進(jìn)入每個細(xì)胞的誘導(dǎo)劑濃度相同。重組蛋白在所有細(xì)胞中的表達(dá)水平相當(dāng)時，減少誘導(dǎo)劑的效果更好。7. 2）檢查密碼子構(gòu)成，使其適應(yīng)宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子，尤其是位于重組蛋白NS的和大量集中的稀有密碼子，會降低 mRNA定性，顯著降低翻譯速度，引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。

10、將這些稀有密碼子（尤其是N端！）突變?yōu)樗拗髌玫拿艽a子，能夠顯著提高表達(dá)水平。改善蛋白穩(wěn)定性。能夠引起蛋白降解的因素很多，從蛋白自身性質(zhì)到宿主性 質(zhì)不一而足，如果重組蛋白在表達(dá)時就被降解，表達(dá)量和穩(wěn)定性就會受到很大影 響。在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白，需要牢記 NS法則：當(dāng)NS第二個殘基是Leu、 Arg、Lys、Phe Tyr和Trp時，重組蛋白半衰期只有2分鐘，而小側(cè)鏈的氨基酸殘 基，如Ala,則可以提高蛋白穩(wěn)定性。因此在設(shè)計(jì)載體時，要特別注意第二個密 碼子，避免上述殘基的出現(xiàn)。處理高毒性蛋白：毒性極高的重組蛋白，其本底表達(dá)就會殺死原核宿主，質(zhì) 粒容易丟失，使其在大腸桿菌中很難得到高表達(dá)。采用

11、可表達(dá)T7容菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RN聚合酶的抑制劑，采用含有T7容菌酶質(zhì)粒的宿主，如pLysS,可 以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達(dá)量，在受到IPTG誘導(dǎo)時也能較 好的表達(dá)蛋白。（3）包涵體表達(dá)：包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、 變復(fù)性條件需要長時間摸索等，即使包涵體蛋白成功復(fù)性，其均一性和活性依然 備受質(zhì)疑。但是包涵體表達(dá)也有其優(yōu)勢：能夠很輕松的獲得超高的表達(dá)量， 不可 溶的重組蛋白不會被宿主內(nèi)的蛋白酶降解， 重組蛋白的毒性被大大抑制，雜蛋白 含量低（10% ,容易純化等。由于這些優(yōu)點(diǎn)以及蛋白質(zhì)復(fù)性條件的不斷發(fā)展， 表達(dá)包涵體蛋白逐漸為人們所接受，成為重

12、組蛋白表達(dá)的一個常用方案。 與可溶 蛋白相反，提高培養(yǎng)溫度、延長培養(yǎng)時間、在較高的菌密度下誘導(dǎo)都有利于包涵 體的形成；在破菌和變性溶解時加入還原劑能夠打開錯配的二硫鍵；在復(fù)性液中加入二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋 白折疊；精氨酸和高分子量PEG9減輕蛋白分子的聚集；嘗試多種物理手段，如 透析、快速稀釋和柱上復(fù)性等，有時對復(fù)性有奇效。包涵體的表達(dá)相對簡單，但 其復(fù)性過程仍是依賴經(jīng)驗(yàn)的，沒有通用的方法可以套用。（三）層析條件的選擇1 .離子交換劑的選擇已知等電點(diǎn)的物質(zhì)，在高于其等電點(diǎn)的pH用陰離子交換劑，在低于其等電 點(diǎn)的pHffl陽離子交換劑。同時要考慮到該物

13、質(zhì)的穩(wěn)定性及溶解度 ，選擇適當(dāng)?shù)?pH范圍。圖1蛋白質(zhì)凈電荷與pH的關(guān)系參照電泳的結(jié)果。在中性或偏堿性條件下進(jìn)行電泳，向陽極移動較快的物質(zhì) 在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附 ，向陰極移動或向陽極移動較慢的可被陽離子交換劑吸附。2 .緩沖液的選擇（ 1）選用的pH 決定于被分離物質(zhì)的等電點(diǎn), 以及穩(wěn)定性和溶解度。選用的緩沖液離子, 其 pK 值要接近于所要用的pH 值 , 這樣有較高的級沖能力, 可避免因緩沖離于與吸附劑相互作用而產(chǎn)生pH 改變。（ 2）緩沖液離子應(yīng)不影響被分離物的活性或干擾其測定。應(yīng)不影響被測物的溶解度, 或會加入一些必要的保護(hù)劑穩(wěn)定目的蛋白，防止變性或者沉淀。3 3） 對于陽

14、離子交換劑應(yīng)使用陰離子型級沖液（如磷酸、醋酸等 ）; 用陰離子交換劑時應(yīng)使用陽離子型級沖液（如 Tr is 、 胺鹽、 吡啶等 ）, 以避免緩沖液離子被吸附而發(fā)生pH 改變。（四）操作步驟1 .離子交換劑的處理（ 1）不同的離子交換劑需要不同的處理，親和層析填料，需要一整套的化學(xué)工藝， 使其結(jié)合上一些親和配基，例如用于純化帶His 標(biāo)簽的Ni2+-sephrose 4B就是將瓊脂搪用環(huán)氧抓丙烷交聯(lián)并加以適當(dāng)處理而制成的，具有配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用強(qiáng)等特點(diǎn)。（ 2）陰離子交換劑和陽離子交換劑的處理：采用堿一酸一堿的順序洗。將干纖維素粉灑在0.5M NaOH 溶液中（每克千纖維素粉

15、約15 毫升堿液）使自然沉降 , 浸泡約30分鐘, 用耐酸漏斗抽濾。如堿液呈黃色, 可重復(fù)洗至無色。用水充分洗凈（用 pH 試紙?jiān)嚦手行裕?。再?0.5 M HCl 洗 , 再水洗 , 再用 N aOH 洗 , 最后充分用水洗。堿洗時難過薄,可加NaCl至0.5M。如仍難過濾,可用10倍水 稀釋 , 使其沉降, 傾去上清液。（3） 調(diào)節(jié)到所需p H 用上述條件的起始緩沖液充分洗滌使達(dá)到所要的p H和鹽濃度。2 .裝柱根據(jù)蛋白表達(dá)量的多少，裝入適當(dāng)?shù)奶盍?，用起始緩沖液充分平衡，用時候?yàn)榱思兇獾氖占鞍?，裝柱沒有太多的要求，當(dāng)然應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎玫姆椒ú灰粯?，相對于需要蛋白紫外吸收圖譜的，需

16、要分辨率較好的或者是過分子篩的，裝柱應(yīng)該注意，裝柱時的注意事項(xiàng)如下:（l）交換劑懸浮液的濃度要適當(dāng)，細(xì)拉子可以濃一些，加抽濾濾餅體積一半的緩沖液即可。粗拉子要稀一些, 太粗的粒子一克干重懸浮于50 一 10 0 毫升中，裝柱時不時搖動梨形瓶使懸浮液均勻。（3 ）注意沉積表面要平, 不平應(yīng)重裝。（4 ）柱中不要混入氣泡, 可放在抽渝瓶中減壓除氣泡。如層析在低溫進(jìn)行, 則可于室溫裝柱, 然后用貯藏在室溫的緩沖液拿到低溫室去淋洗柱, 氣泡即溶解在緩沖液中。（5） 裝柱后必須用起始緩沖液充分淋洗, 使床體積穩(wěn)定并充分平衡使與起始緩沖液有相同的pH 及電導(dǎo)度為止。3 .加樣（ 1）加樣量的多少隨實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

17、不同和樣品中目的物的濃度及其親合力不同而有以下幾種情況:當(dāng)目的物在混合物中的含最極低, 而且是其中被吸附最緊密的 , 為了濃縮富集, 可以將幾倍于柱床體積的樣品通過柱, 直到該成分飽和為止。然后洗脫得到富集物。當(dāng)要求高分辨率時, 加樣時緊密吸附的區(qū)帶不超過床體積的 10 %。 2） 2） 核酸的吸附容量僅為蛋白質(zhì)的1/100 , 可能是由于空間障礙。所以每克干交換劑只能加樣1 毫克。 小分子量物質(zhì)親合力低, 多不能形成緊密的區(qū)帶, 加樣量要少, 體積要小。 3） 加樣方法打開柱流出口, 排除床表面緩沖液,關(guān)閉出口, 用移液管加樣,其先端接觸內(nèi)壁在離床表面數(shù)毫米處, 隨加隨沿柱內(nèi)壁轉(zhuǎn)動一周, 然

18、后速移至中心 , 使樣品盡快均勻分布于全表面。再打開出口, 繼續(xù)加樣 , 待樣品進(jìn)入床內(nèi), 以少量緩沖液沖洗內(nèi)欲數(shù)次, 加滿緩沖液。4. 洗脫洗脫就是改變緩沖液的pH 或離子強(qiáng)度, 降低物質(zhì)的親合力, 使原來緊密吸附的物質(zhì)逐步進(jìn)入有限吸附平衡或解吸狀態(tài)而由柱上洗脫下來。洗脫的辦法有兩種:（ 1）增加緩沖液的離子強(qiáng)度, 使離子的競爭力加大。（ 2）改變pH , 使被分離物質(zhì)的解離度降低, 電荷減少。用陰離子交換劑時降低 pH , 用陽離子交換劑時升高pH。5. 洗脫成分純度的鑒定根據(jù)目的蛋白分子量的大小采用聚丙烯酞胺凝膠盤狀電泳進(jìn)行洗脫成分純度的鑒定，根據(jù)電泳條帶的情況，選擇不同的方法對蛋白進(jìn)行處理。6. 脫鹽可用透析、凝膠過濾或稀釋法處理。透析用1/4 的透析袋對20 倍體積的起始緩沖液透析過夜, 換一次緩沖液再透析6 小時 , 透析時內(nèi)外液均應(yīng)不時攪動。凝膠過油可用交聯(lián)葡聚塘* G 一 25 或 G -5 0 , 先用起始緩沖液平衡, 然后加樣（不超過床體積的2