重組酶介導(dǎo)的核酸快速擴(kuò)增法

1、重組酶介導(dǎo)的核酸快速擴(kuò)增法摘 要 ： 體外核酸快速擴(kuò)增技術(shù)是一種可使微量核酸在體外高效快速擴(kuò)增的技術(shù)。重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增(recombinase-aid amplification,RAA) 技術(shù)是在現(xiàn)有體外核酸擴(kuò)增原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的恒溫體外快速擴(kuò)增核酸技術(shù)。RAA法利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程,實(shí)現(xiàn)了在 37。叵溫下的核酸快速擴(kuò)增，有望在不遠(yuǎn)的將來(lái)取代傳統(tǒng)的熱循環(huán)PCR反應(yīng)。Abstract:Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be ra

2、pidly amplified in vitro . Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at

3、 optimized37C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.關(guān)鍵詞：重組酶 體外核酸擴(kuò)增在過(guò)去1 0年中，若干恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到快速發(fā)展 1,如SDAft術(shù)、TM A技術(shù)、HD徽術(shù)、LAMPK術(shù)和RPAZRAAg術(shù)等。本文介紹的重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增 (r ecombinase-aid amplification,RAA) 技術(shù)是一種在恒

4、溫下可以使核酸快速擴(kuò)增的方法。 與 RPA 不同的是, RAA 擴(kuò)增法使用的是從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶2。在 37恒溫下, 該重組酶可與引物DNA 緊密結(jié)合, 形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA 上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA 結(jié)合蛋白 (singlestrandedDNA binding, SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA 聚合酶的 作用下，形成新的DNA 互補(bǔ)鏈。反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，通常在1 h 內(nèi)即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到的擴(kuò)增片段3 ，整個(gè)反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，因?yàn)椴恍枰邷匮h(huán)，所以特別適合在有大量樣品的非實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)場(chǎng)所使用。1 材料與方法1.

5、1 蛋白和 DNA天藍(lán)色鏈霉菌重組酶蛋白(SC-recA)和枯草芽抱桿菌重組酶蛋(BS-recA)分別來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌.將天藍(lán)色鏈霉菌、枯草芽孢桿菌重組酶基因分別克隆至pET21“達(dá)載體中，過(guò)量表達(dá)后用Ni-NTA親和層析純化，并用Bradford 法定量。重組DNA是rnd基因編碼區(qū)的一部分(310 bp),將此片段連接到載 體上， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含重組DNA 的菌株 (Top10)。1.2 RAA 擴(kuò)增將含有目的片段的大腸桿菌Top10 菌株過(guò)夜培養(yǎng)，從中取出1 mL 菌液，100c力口熱10 min。冷卻至室溫，從中取出1 nL作為擴(kuò)增模板。引物A、B大小 分別為34和3

6、2 nt。反應(yīng)體系如下：50 pmol引物A; 50pmol引物B; 1 mmol/L dNTP; 90 ng/ L SSB白；120ng/ L recA 重組酶蛋白(SC-recA/BS-recA);30 ng/仙 L Bsu DNA 聚合酶；反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L Tricine , pH 8.0; 100 mmol/L 醋酸鎂；5mmol/L 二硫蘇糖醇； 5%PEG 20K; 2.5 mmol/L ATP; 100 ng/仙 L 肌 酸激酶)。搖勻后放置于37c培養(yǎng)箱溫浴1 ho取10仙L反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿提純 后， 在 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。2 結(jié)果與分析在細(xì)菌或真菌D

7、NA 復(fù)制過(guò)程中，重組酶蛋白起著重要的作用。重組酶蛋白可與單鏈DNA結(jié)合而阻止細(xì)胞核內(nèi)核酸酶對(duì)單鏈 DNA的降解，在DNA重組過(guò)程中， 重組酶還負(fù)責(zé)基本的堿基配對(duì)4 。當(dāng)然，在體內(nèi)，還會(huì)有其他輔助性蛋白，如 recB， recC 和單鏈 DNA 結(jié)合蛋白等，共同參與到DNA 的重組中。因此，在進(jìn)行核酸體外擴(kuò)增時(shí)，重組酶蛋白無(wú)疑是起著決定性作用的反應(yīng)催化劑。為了驗(yàn)證重組酶的作用，設(shè)計(jì)了有針對(duì)性的RAA擴(kuò)增體系，除了 SC-recA、BSrecA重組酶外，還加入了DNA 聚合酶和輔助蛋白Bsu 等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在目前的反應(yīng)體系中，含有SC-recA 和 BS-recA 重組酶的反應(yīng)體系都可以正確

8、擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明SC-recA 和 BS-recA 重組酶均具有催化功能，而且反應(yīng)的特異性很高。擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng) 310 bp,是之前克隆到載體里 的 rnd 基因編碼區(qū)的一部分。3 討論3.1 重組酶蛋白在RAA 反應(yīng)中的作用重組酶都能夠與DNA 緊密結(jié)合，這是使核酸體外擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵DNA 模板的解鏈和促使模板與引物之間發(fā)生鏈替換，隨后在 DNA 聚合酶的催化下，擴(kuò)增出新的DNA片段 5。這一替換過(guò)程需要ATP 來(lái)提供能量，然后在單鏈結(jié)合蛋白的輔助下，Bsu DNA聚合酶可以對(duì)鏈替換后的目的DNA進(jìn)行特異地延伸。由于ATP在CK激 酶催化下可以利用磷酸肌酸（phosphocre

9、atine疾現(xiàn)再生，使這一反應(yīng)過(guò)程中的化學(xué) 平衡傾向于產(chǎn)物的合成，并且這一過(guò)程可以被不斷地重復(fù)，從而最終實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。3.2 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增法反應(yīng)的建立和優(yōu)化在 RAA 反應(yīng)中，酶無(wú)疑是最重要的成分，酶的純度直接決定了反應(yīng)能否順利進(jìn)行，因?yàn)榉磻?yīng)僅在37下進(jìn)行，任何不必要的雜質(zhì)都會(huì)影響到反應(yīng)的結(jié)果，特別是核酸酶的污染，而核酸酶在傳統(tǒng)的高溫PCR 中幾乎可以被忽略。因此， 在進(jìn)行酶的純化時(shí)，特別強(qiáng)調(diào)核酸酶的去除，以及保持酶的活性。通過(guò)Ni-NTA 親和層析（Ni-NTA agarose可以去掉大部分雜質(zhì)，獲得高純度的酶.每個(gè)反應(yīng)中酶的 定量也很重要，除了重組酶,還有34 個(gè)酶參與擴(kuò)增反應(yīng)，它

10、們之間需要合理的比例，才能夠得到預(yù)期的擴(kuò)增結(jié)果。RAA常溫核酸擴(kuò)增法對(duì)模板是不挑剔的， 可以是質(zhì)粒DNA ,也可以是含有質(zhì) 粒的菌液，動(dòng)植物DNA均可以作為模板。甚至可以使用 RNA直接作為模板，而 無(wú)需額外的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。但是為了提高擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性，RAA 對(duì)引物的要求比較嚴(yán)格。通常1 對(duì)引物需要由3034 個(gè)核苷酸組成，且引物的序列要與擴(kuò)增片段嚴(yán)格互補(bǔ)，只有這樣，才能獲得理想的擴(kuò)增條帶。RAA方法中引物與模板嚴(yán)格互補(bǔ)的特點(diǎn)，使其可以用于 SNP和甲基化的檢 測(cè)，只要與引物配對(duì)的模板DNA上有一個(gè)堿基的差異，就可以用 RAA方法檢測(cè) 出來(lái)。在 RAA 反應(yīng)體系的優(yōu)化中，緩沖液也是關(guān)鍵的部分。

11、因重組酶催化的反應(yīng)是一個(gè)耗能的反應(yīng)，需要ATP 的參與，所以在緩沖液中，ATP 和促使 ATP 再生的肌酸激酶（creatine kinase）tB是必不可少的成分。同時(shí)，加入了有穩(wěn)定和提高酶 活性作用的聚乙二醇（PEG20000和二硫蘇糖醇（DTT）等。整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)弱堿的 環(huán)境下進(jìn)行，Tris 緩沖液的pH 為 8.0.經(jīng)過(guò)優(yōu)化的反應(yīng)體系在簡(jiǎn)單的反應(yīng)條件下（37c反應(yīng)1 h）,已經(jīng)基本上能夠穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增大小為310 bp的目的片段，而且具有很 高的特異性。3.3 RAA 常溫?cái)U(kuò)增的應(yīng)用前景R A A技術(shù)的優(yōu)勢(shì)使其有望在很大程度上代替?zhèn)鹘y(tǒng)的PC R技術(shù)。由于傳統(tǒng) 的P C R技術(shù)受儀器和空間的

12、限制，使得現(xiàn)有核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值沒(méi)有被充 分挖掘出來(lái)。RAA技術(shù)不依賴(lài)于P C R儀器的便捷性能，是革命性的技術(shù)突破，能充分?jǐn)U大核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。止匕外，R A A技術(shù)還能完成多重引物擴(kuò)增， 配合熒光儀，可形成一套R(shí)AA多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，即利用不同顏色的熒光 標(biāo)記，在同一個(gè)反應(yīng)里檢測(cè)到不同的目的基因，這是其他恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)或巢式P C R技術(shù)無(wú)法相比的特點(diǎn)。隨著RAA技術(shù)的進(jìn)一步深化、完善，在RAA技術(shù)的基礎(chǔ)上可以很快地研發(fā)出適合家庭使用的分子診斷試劑，使全國(guó)乃至全球?qū)Σ《拘院瓦z傳性疾病的定 期和快速普查在技術(shù)上成為可能。這將是一個(gè)非常巨大的潛在市場(chǎng)，其經(jīng)濟(jì)意義到蛋白質(zhì)、糖類(lèi)或

13、其他大分子化合物。同時(shí)，RAA技術(shù)也可作為一種基礎(chǔ)的研 究手段，進(jìn)一步促進(jìn)分子生物學(xué)的研究。RAA技術(shù)極有可能幫助功能基因組學(xué) 和植物分子生物學(xué)獲得突破性進(jìn)展，進(jìn)而形成更加巨大的生物科技產(chǎn)業(yè)。 參考文獻(xiàn) 1 Gill p, Ghaemi A, Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nulcleo sides, nucleotidesnucleic acids, 2008, 27:224-2432 彭濤 . 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用. 北京 : 科學(xué)出版社, 2009. 983 呂蓓，程海榮，嚴(yán)慶豐，等用重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)快速擴(kuò)增核酸中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)， 2010,40(10):983-988.4 Kuzmin