雙孢蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究

1、雙孢蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究中國食用菌2021,29(3):4851EDIBLEFUNG10FCHINACN53-1054/QISSN10038310雙孢蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究劉吟,李成華,吳關威,邊銀丙,黃文f1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,湖北武漢430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學應用真菌研究所,湖北武漢430070)摘要:實驗研究了雙孢蘑菇子實體貯藏期間褐變與總酚含量,酶(PPO和POD)活性,復原糖含量,Vc含量等生化指標之間的關系.結果顯示,貯藏期間雙孢蘑菇子實體茵蓋外表色度值持續(xù)減小,褐變程度加重,總酚和復原糖含量均呈先上升后下降的趨勢,vc含量持續(xù)下降,PPO

2、活性在前5d逐漸增加而后下降,POD活性先增加然后隨著褐變的發(fā)生逐漸下降,而后期大局部褐變發(fā)生時又有所增加.相關性分析顯示褐變程度與色度值之間呈顯著負相關,以色度三值來反映褐變程度可行;Vc含量的變化與色度,J值呈顯著負相關.關鍵詞:雙孢蘑菇;生化指標;褐變中圖分類號:$646.1+1文獻標識碼:A文章編號:10038310(2021)030048-04雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又名白蘑菇,洋蘑菇,是世界上最重要的栽培食用菌之一,但其子實體在采后貯藏及加工過程中極易產(chǎn)生褐變,直接影響雙孢蘑菇的感官品質(zhì)和內(nèi)在質(zhì)量.大大降低了其商品價值,已成為影響雙孢蘑菇鮮銷的主要原因.褐變常伴

3、隨多酚氧化酶(PPO),過氧化物酶(POD)等相關酶活性的變化,褐變程度與總酚含量,復原糖含量,Vc含量等密切相關,也會因采后組織衰老,冷害,熱脅迫,機械損傷,病原微生物污染或其它逆境脅迫等而加速裂變ll1.雙孢蘑菇采摘后.由于其活潑的后熟過程會引發(fā)許多生理生化變化.因此,深入了解雙孢蘑菇采后貯藏期間生理生化的變化對于從理論上認識組織褐變機制,為尋找控制褐變的有效方法提供理論依據(jù),具有重要的理論和現(xiàn)實意義.主要研究了雙孢蘑菇子實體采后貯藏期間總酚含量,相關酶活性,復原糖,Vc等生化特性的動念變化,并對其與褐變的相關性進行分析,探索雙孢蘑菇的褐變機理,為褐變控制提供理論依據(jù).1材料與方法1.1材

4、料雙孢蘑菇(第二潮菇):采白湖北省農(nóng)業(yè)科學院,品種為Ag2796.雙孢蘑菇于下午5時左有采后立即放于冰箱(2±1)預冷14h,次Et凌晨7點將雙孢蘑菇進行分揀,挑選菇體完整,大小均一(菇蓋直徑為50l/ira60Him),顏色潔白,菇蓋未開傘,無病蟲害,無機械傷的雙孢蘑菇進行試驗.1.2實驗方法1.2.1材料處理把符合要求的雙孢蘑菇洗凈晾干后裝人40cmx30cm大小的塑料筐,用PE保鮮袋套筐但不封口,貯藏于低溫f4+11qC的條件下,每天隨機挑取6顆蘑菇觀測貯藏期間其生化和褐變特征的變化.1.2.2子實體褐變程度和色度值的測定褐變程度根據(jù)吳振先刪的方法進行感官鑒定.1級,子實體菌蓋

5、外表無任何褐變;2級,褐變區(qū)域不超過菌蓋外表的1/4;3級,褐變區(qū)域占菌蓋外表的1/4到1/2;4級,褐變區(qū)域超過菌蓋外表的1/2;5級,子實體菌蓋表面完全褐變.采用UltraScanXE型色度測試儀,測量雙孢蘑菇子實體菌蓋外表的色度值,平行測定數(shù)次取平均值.用值表示.L一0為黑色,L一1o0為白色.值越大,表示顏色越白.褐變程度越輕.1.2.3總多酚含量的測定FolinCiocaiheu比色法,參見李靜等的方法嘲,稍做改動.稱取剪碎混勻的菇2g,用80mL水洗人100mL容量瓶中,1O0C沸水浴30min,冷卻,定容,過濾.濾液稀釋適當倍數(shù)后,取1.0mL分別加人水5.0mL,FC顯色劑(自

6、制)1mL和7.5%碳酸鈉溶液3mL,顯色.放置2h后.在760llm波長下測定樣品的吸光度,再根據(jù)標準曲線計算樣品中總多酚含量.1.2.4相關酶活性的測定工程來源:國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系課題組,子課題"食用菌標準化平安生產(chǎn)技術體系建立與標準"作者簡介:劉吟.碩士研究生.主要從事食用菌的保鮮技術研究通訊作者:E-mail:huangwen027yahoo.oom 收稿日期:20210322第29卷第3期劉吟等:雙孢蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究49(1)PPO活力的測定多酚氧化酶(PPO)活力的測定方法,稍做改動.稱取剪碎混勻的菇1.0g,少許石英砂,7.0mL預冷

7、過的50mmol?LpH7.0的磷酸緩沖溶液PBS(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨,低溫離心15min(24,10000r?min),上清液為酶提取液.比色杯中參加0.1mol?L一鄰苯二酚溶液0.4mL及醋酸緩沖液(pH5.0)2.5mL,于250C水浴中恒溫加熱10min,參加0.5mL酶提取液.用磷酸緩沖液代替酶液做空白對照.410nm波長下測定其吸光值(A),每隔30S讀數(shù)1次,共讀3min.以吸光值對時間做圖,取反響最初的直線局部,1個活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘引起吸光值改變0.01所需的酶量.(2)POD活力的測定愈創(chuàng)木酚氧化法51.稱取剪碎混勻的菇5.0g.少許石

8、英砂,5.0mL預冷過的0.1mol?LpH5.5乙酸一乙酸鈉緩沖液(內(nèi)含4%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨,低溫離心(10000r?rain,4)30rain,上清液為酶提取液.比色皿中順序參加25mmo?L愈創(chuàng)木酚3mL,上述酶提取液0.5mL,0.5mol?LH2O2溶液200ILL,迅速混勻并同時立即計時,在反響15S時開始記錄470nm吸光值,作為初始值,每隔30S記錄1次,連續(xù)記錄6min,以滅活的酶液作為參比.以吸光值對時間做圖,取反響最初的直線部分,1個活力單位(U)定義為在測定條件下每分鐘引起吸光值改變0.01所需的酶量.1.2.5復原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)

9、法l5I.1.2.6Vc含量的測定紫外快速測定法問,稱取剪碎混勻的菇5.0g,參加5mL1%鹽酸勻漿,轉移至25mL容量瓶中,稀釋定容.離心(10000r?rain)10min后,取0.2mL上清液,參加盛有0.2roLl0%鹽酸的10mL容量瓶中,定容后以蒸餾水為空白,在243nm處測定吸光值.根據(jù)標準曲線,計算Vc含量.1.3數(shù)據(jù)處理所有實驗均重復3次,并取平均值用于分析.數(shù)據(jù)均采用EXCEL2003及其相關方法進行處理和分析,使用統(tǒng)計軟件SASV8進行顯著性及相關性分析.2結果與分析2.1雙孢蘑菇貯藏期間子實體菌蓋外表褐變程度和色度值的變化通過觀測雙孢蘑菇貯藏期間子實體菌蓋外表褐變程度和

10、色度值的變化情況(見圖1),分析兩者間的對應關系,來探討將雙孢蘑菇褐變程度數(shù)量化的可行性.由圖1可知.貯藏1d后,雙孢蘑菇子實體菌蓋外表褐變開始發(fā)生.并且隨著貯藏期延長褐變程度逐漸加重.褐變區(qū)域面積逐漸擴大,4d后褐變速度加劇,同時值也由最初的86.75降至貯藏末期的77.76.褐變程度與色度值之間呈顯著負線性相關(P<0.01),回歸方程為一貯藏時fHJ/d褐變程度圖1雙孢蘑菇貯藏期間子實體菌蓋外表褐變程度和色度值的變化2.2077X+89.346,R2=0.9603.因此,通過測量雙孢蘑菇子實體外表的色度值,來反映其褐變程度是可行的.2.2雙孢蘑菇貯藏期間子實體總酚含量的變化

11、褐變現(xiàn)象主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的.羅曉芳等嘲研究發(fā)現(xiàn),果實內(nèi)總酚含量與其褐變密切相關.為了探討雙孢蘑菇子實體內(nèi)總酚含量是否也與其褐變相關,觀測了雙孢蘑菇貯藏期間子實體總酚含量的變化情況,見圖2.【i缸寄貯藏時間,d圖2雙孢蘑菇貯藏期間子實體總酚含量的變化由圖2可知,雙孢蘑菇子實體中的總酚含量很高,達到895.8g?g-iFW,高于慈菇l1_,蓮藕嘲,山藥【l01,甘薯1】等大多數(shù)根莖類蔬菜.較高的酚含量賦予雙孢蘑菇較強的褐變潛力.貯藏初期雙孢蘑菇組織中總酚含量逐漸上升,于第4天到達最大值1219.4g?g-iFW,這可能是由于采摘造成的機械損傷引起受傷組織周圍的細胞產(chǎn)生

12、更多酚類,增加的酚類物質(zhì)可參與組織的傷愈過程,這一結果與許多以其他蔬菜為試材報道的研究結果一致".之后隨著貯藏時間進一步延長.總酚含量又快速減少,6d后下降速度減慢,至貯藏結束時的第7天降為482.8Ixg?g-1FW.貯藏后種瑚咖湖咖伽瑚050中國食用菌EDIBLEFUNGIOFCHINAVo】.29No.3期,雙孢蘑菇水分散失,膜脂過氧化作用加劇,導致細胞膜破壞,使本來被隔離的酚類底物與酶類結合,反響,造成酚類含量的減少.褐變明顯.由圖l和圖2比擬可知,酚類物質(zhì)的明顯減少與褐變速度加劇均出現(xiàn)在4d后,時間相吻合,且隨著褐變程度的加深.總酚含量也逐漸減少.因此,可以認為雙孢蘑菇貯藏

13、期間酚類物質(zhì)的減少是由于其被氧化成黑色物質(zhì)導致褐變所致,這與陶菲【21的博士論文報道也相一致.2.3雙孢蘑菇貯藏期間相關酶活性的變化2.3.1雙孢蘑菇貯藏期間PPO活性的變化多酚氧化酶(PPO)是雙孢蘑菇中存在的一類含銅的末端氧化酶.一般認為,采摘前果蔬體內(nèi)PPO主要存在于完整細胞的質(zhì)體(包括葉綠體,有色體和白色體)和微體中,而PPO的底物存在于液泡中,處于潛伏狀態(tài),通過一系列膜系統(tǒng)使兩者區(qū)域化分布.而采摘后由于衰老或其它一些不良環(huán)境條件因素,可引起果實中正常膜結構的破壞而造成酚類物質(zhì)與PPO結合,導致組織褐變.通過雙孢蘑菇貯藏期I葡PPO活性的變化情況(圖3),來推測雙孢蘑菇采后子實體內(nèi)PP

14、O活性與其褐變的相關性.臣已螺07貯藏時J司,d圖3雙孢蘑菇貯藏期間PPO活性的變化由圖3可知,雙孢蘑菇貯藏前期子實體的PPO活性逐漸升高.第5天到達最高值119.1U?g-tFW左右.對這段貯藏期間色度值與PPO活性相關性進行分析,結果顯示兩者呈線性負相關.相關系數(shù)為一0.90459.這與國內(nèi)外許多學者對荔枝131,馬鈴薯,蓮藕等果蔬中PPO參與酶促褐變反響研究的結論是相似的.貯藏5d后,PPO活性水平開始下降,這可能與褐變組織中減少的酶反響底物或者積累較高的褐變產(chǎn)物有關.2-3.2雙孢蘑菇貯藏期間POD活性的變化過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)抵御活性氧傷害的重要酶類.POD對減少活性氧積累

15、,抵御膜脂過氧化和維護膜結構的完整性有重要作用Il2J.另外,也有報道指出POD在H:O:存在下能催化酚類,類黃酮的氧化和聚合,導致組織褐變.通過研究雙孢蘑菇貯藏期間POD活性的變化情況(圖4),對雙孢蘑菇子實體內(nèi)POD的作用機制進行初步推測.由圖4可以看出,采后1d,POD活性快速增加,可以認為是采后逆境的脅迫所致,誘發(fā)細胞產(chǎn)生POD來抵御活性氧的傷害.之后隨著褐變的發(fā)生,POD活性降低,姆0023貯藏時間/d圖4雙孢蘑菇貯藏期間POD活性的變化但當貯藏后期出現(xiàn)大局部褐變時,POD活性又有所增加,可以推測出POD可催化某些酚類物質(zhì)的氧化,參與了雙孢蘑菇的褐變過程.這與吳振先【報道的荔枝果皮P

16、OD活性的變化,及杜傳來l1_報道的鮮切慈菇POD活性的變化特點相類似.2.4雙孢蘑菇貯藏期間復原糖含量的變化羰氨褐變是非酶褐變的重要途徑,復原糖作為羰氨反應的直接反響物,其含量的變化對非酶促褐變有較大影響.復原糖是呼吸基質(zhì),其含量的變化大小也反映了生理生化的代謝強弱及采后腐爛的程度.因此,研究了雙孢蘑菇貯藏期間復原糖含量的變化情況(見圖5),以期尋找雙孢蘑菇子實體采后褐變中是否存在非酶促褐變的可能.卿抽絮貯藏時間/d圖5雙孢蘑菇貯藏期間復原糖含量的變化由圖5可以看,貯藏初期復原糖含量呈增加趨勢,這與Hammandt61等對雙孢蘑菇采后組分變化的研究結果基本一致.推測是菇體為了滿足采后機體呼吸

17、代謝的需要而不斷合成而來的,可能真正進入五碳糖磷酸途徑的很少,因而導致復原糖的積累.而此時較高含量的復原糖可能又促使雙孢蘑菇發(fā)生羰氨非酶促褐變或其他代謝,貯藏4d后隨著褐變的發(fā)生復原糖不斷轉化而表現(xiàn)為逐漸下降.這一結果與王耀松口71報道的蟹味菇采后復原糖含量變化情況相類似.但確實的作用機制還需進一步研究.2.5雙孢蘑菇貯藏期間Vc含量的變化果蔬在貯存過程中發(fā)生褐變,抗壞血酸含量會隨之發(fā)生變化.一般認為,Vc自動氧化后生成含雙羰基化合物,能進一步發(fā)生變化,聚合等形成有色物質(zhì).氨基酸,蛋白質(zhì)等含氮物與變化了的Vc又能夠發(fā)生化學反響從而大大加速褐變.這種反響可能是因為Vc與氨基酸之間發(fā)生了如如舳伯0

18、第29卷第3期劉吟等:雙孢蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究51羰氨反響所致I.但是,雙孢蘑菇子實體采后是否存在這種形式的褐變反響還未見報道,因此研究了雙孢蘑菇貯藏期間Vc含量的變化情況如圖6所示.'bi缸U?貯藏時間,d圖6雙孢蘑菇貯藏期間Vc含量的變化圖6顯示雙孢蘑菇貯藏期間Vc含量持續(xù)下降.貯藏結束時僅為開始貯藏時的39.5%.相關性分析結果顯示.Vc含量與色度,J值呈顯著負相關(P<0.05),說明Vc氧化等引起的非酶褐變可能也是造成雙孢蘑菇褐變的重要因素之一.3討論3.1雙孢蘑菇褐變程度數(shù)量化目前,文獻報道中關于雙孢蘑菇褐變程度的描述主要有3種方式:感官鑒定,

19、根據(jù)分級標準進行判斷,這種方法可能會受到鑒定者的個體差異以及光線的影響:褐變度測定,提取蘑菇中的褐色物質(zhì),在一定波長下測定吸光度值,這種方法會破壞樣品的完整性,且消耗較多的人力和物力;色度儀測定,測定蘑菇菌蓋外表的白度值,根據(jù)Gormley的分類標準,白度值85為好品質(zhì)菇,在8085之間為可接受品質(zhì)菇來判斷,這種方法迅速,準確,方便.目前利用色度儀來研究果蔬褐變程度已有很多報道,但有關雙孢蘑菇利用色度儀測定的白度值與感官鑒定的褐變程度是否有顯著的相關性,兩者是如何對應的還未見報道.實驗結果說明,通過測量雙孢蘑菇子實體外表的色度值,來反映其褐變程度是可行的,兩者呈顯著負相關關系<O

20、.01).3.2雙孢蘑菇的褐變雙孢蘑菇采后貯藏期間的研究結果顯示,與酶促褐變有關的主要生化指標,酚類底物,PPO,POD酶活性變化與褐變密切相關.酚類物質(zhì)的明顯減少與褐變速度加劇的時間點吻合,且隨著褐變程度的加深,總酚含量也逐漸減少,而PPO和POD共同作用影響褐變;與非酶促褐變有關的主要生化指標一復原糖和Vc含量的動態(tài)變化情況也與褐變的發(fā)生存在一定的關系,其中Vc含量與色度三值變化顯著相關,說明雙孢蘑菇中可能有非酶促褐變存在.需要指出的是,通過研究這些指標的動態(tài)變化情況.僅能表征隨著褐變的發(fā)生這些指標是如何變化的,但并不能確定這些指標一定能直接作用于褐變及如何作用于褐變.目前的研究結果僅能提

21、供局部理論依據(jù)及一些推測分析雙孢蘑菇貯藏中的褐變可能不僅與酚類底物,PPO和POD活性,復原糖和Vc含量等指標的變化有關,還可能與呼吸強度,苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,超氧化物歧化酶(SOD)活性,蛋白質(zhì)含量及水分含量等指標的變化有關.本實驗僅對雙孢蘑菇采后局部指標的動態(tài)變化情況及其與褐變的關系進行了推測性分析,而其它與褐變有關的生理生化變化,及其之間的作用機理尚有待進一步研究【參考文獻】【1】杜傳來.鮮切慈菇貯藏中褐變的相關生理生化變化及酶促褐變機理的研究D.南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2006.【2吳振先.荔枝果皮褐變程度的數(shù)學模型研究【JJ.果樹,2006,23f51:695-698.3李靜,聶繼云.Folin-Ciocaheus法測定葡萄和葡萄酒中的總多酚J.中國南方果樹,2007,6(36):8687.【4J李寧,郁志芳,趙友興,等.蓮藕多酚氧化酶的酶學特性fJ.江蘇農(nóng)業(yè),2002,18(1):6364.5李合生.植物生理生化實驗原理和技術M.北京:高等教育出版社.2007.【6】趙連俊.水果中維生素C含量測定的研究JJ.當代化工,2021(6):672-673.7】董樹剮,吳以平.植