8DNA羥甲基化

1、分子機(jī)制研究套路（八）DNA （羥）甲基化課題：C因素激活A(yù)蛋白對(duì)B基因啟動(dòng)子DNA甲基化的調(diào)控對(duì) D疾病的影響1 .概念介紹：表觀遺傳學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)普遍關(guān)注的前沿，是一種可遺傳的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制，不同于經(jīng)典遺傳學(xué)，不涉及到基因序列的改變，而且表觀遺傳修飾是可逆的，在基因調(diào)控中起重要作用。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要調(diào)控機(jī)制之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚 胎發(fā)育、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變以及人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。DNA甲基化是指由 S-腺昔甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM ）提供甲基、在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase

2、, DNMT ）的催化下，在胞口密咤的 C5位上面加上一個(gè)甲基，形成5-甲基胞喀咤（5-mC）的化學(xué)修飾過(guò)程。 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如DNMTs）與DNA去甲基化 酶（如TET蛋白等）調(diào)控基因組DNA序列甲基化的動(dòng)態(tài)變化，一般來(lái)說(shuō)，基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而該區(qū)域的去甲基化則可以激活基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化主要發(fā)生在 CpG異二核甘酸上面（如示意圖 1）,而CpG在人類基因組中出現(xiàn) 的幾率比較低，主要集中出現(xiàn)在CpG島（CpG island）上面。CpG島是指由200bp的堿基組成的DNA序列，其中GC含量占60%以上的一個(gè)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域

3、主要位于某些基因的啟 動(dòng)子區(qū)域。CpG島上DNA的甲基化是表觀遺傳學(xué)研究中的一個(gè)重點(diǎn)，其可改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)、影響鄰近基因的表達(dá)。高度甲基化的 DNA與組蛋白結(jié)合緊密并且能夠招募轉(zhuǎn)錄抑制因 子、抑制轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的；而DNA的低甲基化使得染色體結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子和RNA多聚酶與靶序列的結(jié)合，從而驅(qū)使相關(guān)基因的高表達(dá)。圖1: DNA在CpG異二核甘酸上的甲基化示意圖表觀遺傳學(xué)最先用于腫瘤的研究中。在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CpG島高度甲基化，從而抑制抑癌基因的表達(dá)，誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，因此 DNMT抑制劑5-氮胞昔(5-AZA )等被用于腫瘤 的臨床治療。2

4、 .示意圖：DNA甲基化循環(huán)的過(guò)程如圖 2:通過(guò)SAM提供甲基，在DNMT的催化下完成甲基化過(guò)程，于此同時(shí)會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物 S-腺昔高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine, SAH ), SAH進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為高半胱氨酸，而高半胱氨酸是這個(gè)循環(huán)中的關(guān)鍵組分，研究表明升高的高半胱氨酸能夠損傷DNA的修復(fù)機(jī)制，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂。從循環(huán)圖中可以得知，高半胱氨酸具有2條去路，一方面可以形成甲硫氨酸重新參與甲基化循環(huán)，另一方面可以被分解代謝為半胱氨酸。高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸的過(guò)程是在甲硫氨酸合成酶的作用下完成的，但是需要維生素B12和5-甲基四氫葉酸的輔助

5、，而5-甲基四氫葉酸又需要通過(guò)食物中的葉酸轉(zhuǎn)化而來(lái)；高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸也需要維生素B6的參與。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素B6、維生素B12和葉酸的缺乏與高半胱氨酸水平升高密切相關(guān)，因此，可以通過(guò)食物療法來(lái)保證維生素B12、維生素B6和葉酸的供應(yīng)，達(dá)到防止疾病的目的。DMA rnethylatfon cycle7tttrohirofoiatrHomocym 汨圖2: DNA甲基化循環(huán)過(guò)程3 .研究思路:3.1 D疾病中B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與B蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 43.1.1 D疾病組與正常對(duì)照組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平 43.1.2 D疾病和正常對(duì)照組細(xì)胞B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列DNA

6、甲基化水平 43.1.3 D疾病和正常對(duì)照組細(xì)胞B蛋白表達(dá)水平及其與B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列 DNA甲基化水平相關(guān)性分析43.2 補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊報(bào)告載體檢測(cè)DNA甲基化對(duì)B基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.53.2.1 成功構(gòu)建B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列PGL-3promoter熒光素報(bào)告載體53.2.2 質(zhì)粒PCR大量擴(kuò)增B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列片段 53.2.3 體外人工甲基化及甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切鑒定 53.2.4 檢測(cè)CpG甲基化和未甲基化目的片段熒光素報(bào)告載體熒光素活性 53.3 A蛋白對(duì)B基因啟動(dòng)子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制 63.3.1 A蛋白募集去甲基化酶 TET2結(jié)合至B

7、基因啟動(dòng)子序列 63.3.2 A蛋白促進(jìn)細(xì)胞B基因啟動(dòng)子去甲基化 63.3.3 C因素促進(jìn)細(xì)胞 B蛋白表達(dá) 63.1 D疾病中B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與B蛋白表達(dá)相關(guān)性分析3.1.1 D疾病組與正常對(duì)照組細(xì)胞基因組 DNA整體甲基化水平用磁珠分選法分離 10例D疾病患者及正常對(duì)照細(xì)胞，提取基因組DNA ,用MethylampTM整體DNA甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè) D疾病與正常對(duì)照細(xì)胞基因組 DNA整體甲基化水平。結(jié) 果顯示D疾病組細(xì)胞基因組 DNA整體甲基化較正常對(duì)照組明顯 下降。注釋：1）疾病組和對(duì)照組樣品，如果可獲得臨床樣本最好，如果沒(méi)有，可用同一組織類型 的疾病細(xì)胞系和正常細(xì)胞系。

8、2）如果是臨床樣本，細(xì)胞的分離方法不一定是磁珠分選法，還可以用流式細(xì)胞儀分選等，需根據(jù)疾病類型的不同進(jìn)行調(diào)整。3）疾病組DNA整體甲基化水平降低還是升高，關(guān)鍵取決于B基因?qū)膊〉呢暙I(xiàn)，若促進(jìn)疾病，則大多甲基化水平降低；若抑制疾病，則大多甲基化水平升高。3.1.2 D疾病和正常對(duì)照組細(xì)胞 B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列 DNA甲基化水平.首先確定B基因啟動(dòng)子中CpG島的位置，然后在 CpG島內(nèi)確定CpG位點(diǎn)，檢測(cè)所有 CpG 位點(diǎn)DNA甲基化水平。亞硫酸鹽處理基因組 DNA ,巢式PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物，T載體克隆 測(cè)序檢測(cè)調(diào)控序列 CpG島甲基化水平。結(jié)果顯示 D疾病組細(xì)胞B基因啟動(dòng)子區(qū)所有 CpG 位點(diǎn)

9、整體DNA甲基化水平較正常對(duì)照組明顯 降低。3.1.3 D疾病和正常對(duì)照組細(xì)胞 B蛋白表達(dá)水平及其與 B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列 DNA甲基化 水平相關(guān)性分析用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)D疾病和正常對(duì)照組單核細(xì)胞 B蛋白mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示 D 疾病組細(xì)胞B蛋白mRNA水平較正常對(duì)照組明顯升高。用Western blot法檢測(cè)D疾病和正常對(duì)照組細(xì)胞 B蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示D疾病組細(xì)胞B 蛋白水平較正常對(duì)照組明顯升高。D疾病與正常對(duì)照組細(xì)胞 B基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平與B蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。3.2 補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊報(bào)告載體檢測(cè)DNA甲基化對(duì)B基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控3.2.1 成功建B基因啟動(dòng)

10、子調(diào)控序列PGL-3promoter熒光素報(bào)告載體用T4連接酶將B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列片段（用體外甲基化技術(shù)使目的片段CpG甲基化，并用未甲基化作陰性對(duì)照）與酶切處理線狀報(bào)告載體連接，用DH5 “大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化純化載體質(zhì)粒。用雙酶切鑒定，質(zhì)?；蚪M測(cè)序及Pubmed BLAST序列對(duì)比鑒定獲得含有 B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列PGL-3promoter突光素報(bào)告載體。注釋:雙酶切時(shí)具體選擇何種酶取決于質(zhì)粒載體上的多克隆位點(diǎn)，且插入序列中不可含有所用酶的酶切序列。3.2.2 質(zhì)粒PCR大量擴(kuò)增B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列片段為了獲得大量純化的 B基因啟動(dòng)子調(diào)控序列片斷，利用報(bào)告載體為模板，運(yùn)用質(zhì)粒 PCR技

11、術(shù)，大量擴(kuò)增目的片段，利用膠回收技術(shù)純化回收目的片段。3.2.3 體外人工甲基化及甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切鑒定利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶 Aci I酶切鑒定體外甲基化程度，Aci I酶切位點(diǎn)為5 -CACGC-3'或3'-GGQAG- 5'而如果酶切位點(diǎn)受 CpG甲基化保護(hù)不被酶切；體外人工甲基化使 CpG 甲基化組目的片段完全甲基化不被酶切為完整的片段，而模擬甲基化組目的片段未甲基化，被Aci I酶切為兩個(gè)片段，證實(shí)體外人工甲基化成功，獲得完全CpG甲基化/模擬甲基化目的片段。3.2.4 檢測(cè)CpG甲基化和未甲基化目的片段熒光素報(bào)告載體熒光素活性將CpG甲基化和

12、未甲基化目的片段熒光素報(bào)告載體與pRL家族海腎熒光素酶（Rluc）對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)，利用雙熒光素酶報(bào)告載體檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶結(jié)果顯示B基活性，比較CpG甲基化和模擬甲基化目的片段熒光素報(bào)告載體熒光素酶活性。因啟動(dòng)子調(diào)控序列是甲基化敏感位點(diǎn)，B基因啟動(dòng)子受DNA甲基化調(diào)控。3.3 A蛋白對(duì)B基因啟動(dòng)子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制3.3.1 A蛋白募集去甲基化酶TET2結(jié)合至B基因啟動(dòng)子序列分離3例健康志愿者細(xì)胞，用 C因素激活A(yù)蛋白，用免疫共沉淀(IP)法證實(shí)A蛋白募集去 甲基化酶TET2蛋白；用染色質(zhì)免疫共沉淀 (CHIP)-qPCR證實(shí)A蛋白結(jié)合至單核細(xì)胞

13、 B基 因啟動(dòng)子CpG序列。3.3.2 A蛋白促進(jìn)細(xì)胞B基因啟動(dòng)子去甲基化為了證實(shí)A蛋白募集的TET2蛋白是否引起B(yǎng)基因啟動(dòng)子去甲基化，用亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)C因素處理組及對(duì)照組單核細(xì)胞 B基因啟動(dòng)子CpG島上CpG位點(diǎn)DNA甲基化水平。結(jié) 果顯示，C因素處理組B基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平較對(duì)照組明顯下降， 提示A蛋白募集 TET2蛋白導(dǎo)致單核細(xì)胞B基因啟動(dòng)子去甲基化。3.3.3 C因素促進(jìn)細(xì)胞B蛋白表達(dá)在3.2部分已用補(bǔ)丁甲基化熒光素報(bào)告載體技術(shù)證實(shí)B基因轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化調(diào)控，為闡明C因素通過(guò)A蛋白/TET2通路引起的B基因啟動(dòng)子去甲基化是否促進(jìn)細(xì)胞 B蛋白表達(dá)， 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) C因素處理組及對(duì)照組單核細(xì)胞 B蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)C因素促進(jìn)單核細(xì) 胞B蛋白的表達(dá)。4.應(yīng)用案例：1. Liang