組蛋白乙酰化對(duì)衰老雌鼠胚胎發(fā)育影響的研究

1、組蛋白乙?；瘜?duì)衰老雌鼠胚胎發(fā)育影響的研究1前言隨著晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放開(kāi)，生殖健康越來(lái)越成為人們關(guān)注的焦 點(diǎn)。衰老的卵子會(huì)帶來(lái)包括流產(chǎn)在內(nèi)的一系列問(wèn)題，通過(guò)對(duì)衰老卵子影響因素的研究，我們 可以更好地對(duì)卵子質(zhì)量進(jìn)行調(diào)控，提高生殖健康能力。為進(jìn)一步探索與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的年齡的相關(guān)因素，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室比較了年輕 C57BL/6雌鼠（5周）與45周雌鼠的MII卵母細(xì)胞的mRNA的各個(gè)基因表達(dá)量。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序發(fā)現(xiàn)，接近5$的母源物質(zhì)受到了年齡增長(zhǎng)的影響。有趣的是，有很多與表觀修飾相關(guān)的轉(zhuǎn) 錄本受到了年齡增長(zhǎng)的嚴(yán)重影響，例如DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酷化酶等。我們的研究是通過(guò)比較不

2、同年齡雌鼠的受精胚胎的發(fā)育能力發(fā)現(xiàn)哀老雌鼠的生殖能力出 現(xiàn)明顯下降，并出現(xiàn)流產(chǎn)、妊娠率低等現(xiàn)象。該研究通過(guò)在體內(nèi)和體外模擬方式明確了乙酰 化升高是卵母細(xì)胞衰老造成動(dòng)物流產(chǎn)、妊娠率低的一個(gè)重要原因，并且乙?；纳吒淖兞?眾多基因的表達(dá)，從而為人們提高對(duì)卵母細(xì)胞衰老認(rèn)識(shí)、進(jìn)行胚胎質(zhì)量控制提供重要的證據(jù)。2方法1.1 CD-1雌鼠受精卵的獲取我們選取了 810周齡的CD-1雌鼠獲取受精卵和實(shí)驗(yàn)用卵母細(xì)胞。1.2 2w外TSA處理通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)受體分別做添加去乙?；敢种苿㏕SA,和不加TSR處理，放入胚胎培養(yǎng)箱 觀察發(fā)育。囊胚后移植至假孕體內(nèi)觀察體內(nèi)發(fā)育。1.3 假孕雌鼠的制備挑選健康8周齡左右性成熟

3、雌性CD-1品系雌鼠，與同品系輸精管結(jié)扎公鼠合籠交配。 之后通過(guò)檢栓，挑選出假孕雌鼠。1.4 雌鼠胚胎移植對(duì)雌鼠進(jìn)行全身麻醉后，將要移植的囊胚注入假孕鼠輸卵管膨大部中。1.5 免疫熒光染色將要染色的胚胎.按流程進(jìn)行清洗、染色。2. 2. 6 PCR 檢測(cè)按配方進(jìn)行PCR鑒定。3數(shù)據(jù)分析3.1衰老雌鼠生殖能力下降3. 1.1衰老雌鼠受精卵質(zhì)量差我們選取6周和14個(gè)月大的CD-1雌鼠作為研究對(duì)象。通過(guò)超數(shù)排卵的手段對(duì)兩種雌性 雌鼠進(jìn)行激素調(diào)節(jié)，隨后在注射完HCG后，將超數(shù)排卵的雌鼠與雄鼠進(jìn)行合籠，利用輸卵管 沖洗的辦法取出受精卵。通過(guò)在高倍光鏡下檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的受精卵胞質(zhì)發(fā)黑，并 呈顆?；?/p>

4、。該結(jié)果說(shuō)明受精卵的質(zhì)量隨著雌鼠年齡的增長(zhǎng)而變差。3.1. 2衰老雌鼠早期胚胎發(fā)育效率低下我們分別取年輕雌鼠（8周）和衰老雌鼠（14月）的受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察。我們發(fā) 現(xiàn)衰老雌鼠的胚胎發(fā)育率隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多，逐漸下降（佟|3-1）。囊胚率約為年輕雌 鼠的一半。該結(jié)果表明隨著雌鼠年齡的增長(zhǎng)，雌鼠早期胚胎發(fā)育能力下降。3 . 1. 3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)畸形的特點(diǎn)為了更好地排除衰老個(gè)體對(duì)胚胎發(fā)育的影響，我們所選取的假孕均為同一周齡，即均為 8周雌鼠。我們分別向假孕雌鼠體內(nèi)移植衰老雌鼠胚胎51枚，年輕雌鼠胚胎16枚c在雌鼠 孕期19. 5dpc的時(shí)候，檢測(cè)胎兒出生。我們發(fā)現(xiàn)

5、移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有兩個(gè)胎兒 出生，而移植了年輕雌鼠胚胎的假孕有10只胎兒出生，衰老雌鼠胚胎嚴(yán)重降低了胎兒的出生 率及妊娠率。4 .2高組蛋白乙?；绞撬ダ洗剖笈咛ド钞惓５囊粋€(gè)主要原因3. 2.1衰老雌鼠胚胎的乙?；缴哂绊懰ダ洗剖笈咛グl(fā)育能力低下的因素有很多。我們將研究的重點(diǎn)關(guān)注在基因組的表觀 修飾上來(lái)。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙?；?。通過(guò)賴(lài)氨酸乙?；拿庖邿晒?染色，我們發(fā)現(xiàn)衰老雌鼠的乙酰化染色的熒光強(qiáng)度極高（圖3-2）。初步證明了衰老雌鼠的乙 酰化程度增高。3. 2. 2增加年輕雌鼠乙?；潭全@得與衰老雌鼠一樣生理表型我們嘗試在體外培養(yǎng)環(huán)境下，增加年輕雌鼠

6、胚胎的乙?；潭冗M(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn)。TSA是 一種去乙?；敢种苿ㄟ^(guò)向胚胎培養(yǎng)液中添加該試劑，可以顯著提升胚胎的乙?；潭?。 隨后，我們通過(guò)向同為8周雌鼠的胚胎培養(yǎng)液中添加TSA來(lái)增加年輕雌鼠胚胎的乙?；潭?。通過(guò)對(duì)到期雌鼠出生個(gè)數(shù)的比較，我們發(fā)現(xiàn)TSA處理后的年輕胚胎的雌鼠到期效率和年 老雌鼠一致（圖3-3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，乙?；潭壬吆竽贻p雌鼠胚胎獲得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型。3. 2. 3 TSA處理的年輕雌鼠胚胎具有和年老雌鼠類(lèi)似的乙?；潭葹榱舜_定是否TSA處理后年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠類(lèi)似，我們通過(guò)免疫熒 光的手段對(duì)胚胎進(jìn)行染色。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)TSA處理后的雌鼠胚胎，

7、具有了和年老雌鼠相類(lèi)似的乙 酰化程度。結(jié)果說(shuō)明，乙酰化程度改變是衰老雌鼠胚胎質(zhì)量變差的一個(gè)重要原因。4. 3乙?；潭雀淖儗?dǎo)致了一些關(guān)鍵性基因表達(dá)量改變?yōu)榱颂骄恳阴；潭雀淖優(yōu)槭裁磿?huì)造成動(dòng)物流產(chǎn)等現(xiàn)象，我們利用qpcr技術(shù)對(duì)年輕、年 老、TSA處理的胚胎受精卵進(jìn)行了基因表達(dá)量的鑒定，通過(guò)鑒定，我們發(fā)現(xiàn)包括PeglO在內(nèi) 的多個(gè)對(duì)胚胎發(fā)育到期的重要基因的表達(dá)量相對(duì)于野生型較高，并存在顯著差異（圖3-4）o 因此，乙酰化程度改變很有可能是增強(qiáng)了多個(gè)關(guān)鍵性基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致基因表達(dá)紊亂， 造成了胎兒發(fā)育雌鼠問(wèn)題與障礙。4結(jié)論1 .衰老雌鼠胚胎的乙?；皆龈?；2 .通過(guò)體外模擬發(fā)現(xiàn)乙?；缴呤窃斐伤ダ洗剖笈咛グl(fā)育能力下降的一個(gè)主要原因:3 .乙酰化程度