-淀粉酶的提取要點(diǎn)0001

1、a -淀粉酶的提取、分離及測(cè)定（生化試驗(yàn)小組-2005.4）試驗(yàn)全程安排:第一天樣品的粗處理及粗分離，包括：1）樣品處理2）離子交換色譜分離3）紫外檢測(cè)（紫外測(cè)定蛋白），繪出色譜圖4）收集樣品第二天對(duì)各峰收集樣品進(jìn)行分析，包括：1）精確測(cè)定蛋白含量（Folin-酚）2）測(cè)定酶活3）比活計(jì)算第三天對(duì)活性峰及原液進(jìn)行分析及鑒定，包括：1）SDS- PAGE分析（分子量分析）2）純化倍數(shù)計(jì)算等試驗(yàn)一、色譜分離淀粉酶1.1試劑及設(shè)備離子交換樹(shù)脂-20 C冰箱樣品管（5-10ml試管）1.5ml離心管紫外分光光度計(jì)a-淀粉酶樣品秒表膠頭吸管（進(jìn)樣用）平衡緩沖液（pH8.0 , 0.01M磷酸鹽緩沖液）洗

2、脫緩沖液（平衡緩沖液 +0.1M , 0.3M , 0.5M , 1.0M的氯化鈉） 試劑瓶1.2離子交換色譜原理與方法色譜（chromatography）是一種分離的技術(shù)，隨著現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生。20世紀(jì)初在俄國(guó)的波蘭植物化學(xué)家茨維特（Twseet）首先將植物提取物放入裝有碳酸鈣的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸鈣中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈現(xiàn)出不同的顏色，這樣就可以對(duì)各種不同的植物提取液進(jìn)行有效的成分分離。到1907年茨維特的論文用俄文公開(kāi)發(fā)表，他把這種方法命名為chromatography,即中文的色譜，這就是現(xiàn)代色譜這一名詞的來(lái)源。但由于茨維特當(dāng)時(shí)沒(méi)有知名度， 而且能看懂

3、俄文的人也不多， 加之很快爆發(fā)了第一次世界大 戰(zhàn)，茨維特的分離方法一直被束之高閣。20 世紀(jì)20年代，許多植物化學(xué)家開(kāi)始采用色譜方法對(duì)植物提取物進(jìn)行分離， 色譜方法才被廣泛地應(yīng)用。 自20世紀(jì)40年代以來(lái)以 Martin 為首的 化學(xué)家建立了一整套色譜的基礎(chǔ)理論使色譜分析方法從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)方法總結(jié)歸納為一種理 論方法，馬丁等人還建立了氣相色譜儀器使色譜技術(shù)從分離方法轉(zhuǎn)化為分析方法。20世紀(jì)50年代以后由于戰(zhàn)后重建和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，化學(xué)工業(yè)特別是石油化工得到廣泛的發(fā)展， 亟需建立快速方便有效的石化成分分析。 而石化成分十分復(fù)雜， 結(jié)構(gòu)十分相似， 且多數(shù)成分 熔點(diǎn)又比較低，氣相色譜正好吻合石化成分分

4、析的要求，效果十分明顯、有效。同樣，石化 工業(yè)的發(fā)展也使色譜技術(shù)特別是氣相色譜得到廣泛的應(yīng)用。 氣相色譜的儀器也不斷得到改進(jìn) 和完善，氣相色譜逐漸成為一種工業(yè)分析必不可少的手段和工具。20世紀(jì) 80年代以后我國(guó)也大規(guī)模采用氣相色譜和高效液相色譜。 隨著環(huán)境科學(xué)的發(fā)展， 不僅需要對(duì)大量有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行分離和檢測(cè)，而且也要求對(duì)大量無(wú)機(jī)離子進(jìn)行分離和分析。1975年美國(guó)Dow化學(xué)公司的H.Small等人首先提出了離子交換分離抑制電導(dǎo)檢測(cè)分析思維 即提出了離子色譜這一概念離子。色譜概念一經(jīng)提出便立即被商品化產(chǎn)業(yè)化由Dow公司組建的Dionex公司最早生產(chǎn)離子色譜并申請(qǐng)了專利。我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始引進(jìn)

5、離子色譜儀器，在我國(guó)八五、 九五科技攻關(guān)項(xiàng)目中均列有離子色譜國(guó)產(chǎn)化的項(xiàng)目， 對(duì)其進(jìn)行了重點(diǎn)技術(shù) 攻關(guān)。色譜的分類色譜的分類有多種，主要按兩相的狀態(tài)及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可分為兩大類1. 按應(yīng)用領(lǐng)域不同分類 制備色譜 半制備色譜2. 以流動(dòng)相和固定相的狀態(tài)分類 氣相色譜、氣固色譜、氣液色譜、液相色譜、液固 色譜、液液色譜、超臨界色譜、毛細(xì)管電泳離子交換色譜 離子色譜分離主要是應(yīng)用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹(shù)脂來(lái)分離離 子。它在離子色譜中應(yīng)用最廣泛， 其主要填料類型為有機(jī)離子交換樹(shù)脂， 以苯乙烯二乙烯苯 共聚體為骨架在苯環(huán)上引入磺酸基形成強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂， 引入叔胺基而成季胺型強(qiáng)堿 性

6、陰離子交換樹(shù)脂，此交換樹(shù)脂具有大孔或薄殼型或多孔表面層型的物理結(jié)構(gòu)以便于快速 達(dá)到交換平衡。 離子交換樹(shù)脂耐酸堿， 可在任何 pH 范圍內(nèi)使用， 易再生處理， 使用壽命長(zhǎng)。 缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度差，易溶脹，易受有機(jī)物污染。離子色譜基本流程圖如下圖所示：JI色譜柱檢測(cè)池抑制器口7'腫T£0產(chǎn)泉液進(jìn)樣分離檢測(cè)離子交換的分類及常見(jiàn)種類（一）分類離子交換劑分為兩大類，即陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強(qiáng)、弱兩種，即強(qiáng)酸劑陽(yáng)離子交換劑弱酸劑 強(qiáng)鹼型陰離子交換劑 弱鹼型。1. 陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-S03H ）、磷酸（-PO3H2 ）、

7、羧酸（COOH ）和酚羥基（-0H）等酸性基。某些交換劑在交換時(shí)反應(yīng)如下：強(qiáng)酸性：R-S03 -H+ + Na+ R-S03- Na+H+弱酸性：R-C00H + Na+ R-C00Na + H+國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂中強(qiáng)酸 1×7 （上海樹(shù)脂# 732）和國(guó)外產(chǎn)品 Dowex 50、Zerolit 225等都于強(qiáng) 酸型離子交換劑。2. 陰離子交換劑陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2 ）、仲胺（-NHCH3 ）、叔胺N- （ CH3 ） 22 Cl + 0H-2 HCl + 0H-等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。和季胺-N （CH3 ） 2等鹼性基團(tuán)。某些交換反應(yīng)如下： 強(qiáng)鹼性：R

8、-N+ （CH3） 2 H·OH- + Cl R-N+ （CH3） 弱鹼性：R-N+ （CH3） 2 H·OH- + Cl R-N+ （CH3） 強(qiáng)鹼性# 201號(hào)國(guó)產(chǎn)樹(shù)脂和國(guó)外 Dowex1、Dowex2、ZerolitFF（二）種類CM-纖維素），陰離子交換劑有氯代1. 纖維素離子交換劑：陽(yáng)離子交換劑有羥甲基纖維素（三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。2. 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應(yīng)，是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離物質(zhì)。常用的Sep hadex離子交換劑也有陰離子和陽(yáng)離子

9、交換劑兩類。陰離子交換劑有DEAE-Sephadex A-25 , A-50和 QAE- Sephadex A25 ,A50 ; 陽(yáng)離子交換劑有 CM-Sephaetx C-50 , C-50 和 SephadexC-25 , C-50。陰離子交換劑用英文字頭 A，陽(yáng)離子交換劑的英文字頭是 C。英文字后面的數(shù)字表示Sephadex型號(hào)。3.瓊脂糖離子離交換劑：是將DEAE-Sephades （陰離子）和 流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。DESE-或CM-基團(tuán)附著在Sepharose CL-6B上形成，CM-Sepharose （陽(yáng)離子），具有硬度大，性質(zhì)穩(wěn)定，凝膠后的交換劑的處理，再生與轉(zhuǎn)型要用水浸

10、透使之充分吸水膨脹。因其含有政績(jī)一些雜質(zhì)，所要新出廠的樹(shù)脂是干樹(shù)脂，1.2.3.4.新出廠干樹(shù)脂用水浸泡 2小時(shí)后減抽壓去氣泡，傾去水，再用大量無(wú)離子水洗至澄清, 去水加4倍量0.1-2N HCl攪抖4小時(shí)，除去酸液，水洗到中性 再加4倍量0.1-2N NaOH攪抖4小時(shí)，除鹼液， 將樹(shù)脂帶上所希望的某種離子的操作稱為轉(zhuǎn)型。攪拌浸泡2小時(shí)以上；如希望樹(shù)脂帶H+ ,帶Cl-則用HCI，希望帶 OH-則用NaOH?？捎盟吹街行詡溆?。如希望陽(yáng)樹(shù)脂帶 Na+ ,則用4倍量NaOHHCI處理。陰樹(shù)脂轉(zhuǎn)型也同樣，若希望再生：用過(guò)的樹(shù)脂使其恢復(fù)原狀的方法稱為再生。 要轉(zhuǎn)型處理就行了。并非每次再一都用酸、鹼

11、液洗滌,往往只樹(shù)脂保存方法放置于20%酒精中，4 C冰箱保存。使用過(guò)的樹(shù)脂用大量的去離子水洗至中性后，時(shí)，需先用大量的去離子水洗至中性，再用0.5N氫氧化鈉和0.5N氯化鈉處理0.5小時(shí),洗至中性即可使用。再次使用柱上操作交換劑裝柱最簡(jiǎn)單的交換層析柱可用鹼式滴定管代替。處理過(guò)的樹(shù)脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹(shù)脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。裝柱前應(yīng)先在柱內(nèi)保留1/3的緩沖液，并排除柱底部氣泡，然后再傾入樹(shù)脂。上樣：向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液 洗脫與收集不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子, 來(lái)。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)， 制

12、流速和分布收集的方法來(lái)獲得所需的單一物質(zhì)。把吸著物交換出因此除了正確選擇洗脫液外還采控1.3試驗(yàn)流程1.3.1粗酶液的制備將一定量的發(fā)酵酶粉溶于醋酸鈉或者磷酸鹽緩沖液中, 離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清夜進(jìn)行分離。4 C浸泡 12h, 1 X 104r/min , 4 C要用水、酸、鹼洗滌。一般手續(xù)如下:（備注：這一步驟已完成 ）1.3.2 色譜柱的準(zhǔn)備（裝柱） 按標(biāo)準(zhǔn)方法將離子交換樹(shù)脂裝填于色譜柱內(nèi)，用平衡緩沖液平衡。1.3.3 a -淀粉酶的分離將一定量的樣品溶液緩慢上入色譜柱內(nèi)，先后用平衡緩沖液和洗脫緩沖液洗滌，每隔2分鐘收集一次樣品， 每個(gè)樣品檢測(cè)280nm的吸光值，繪出色譜曲線。將

13、每個(gè)峰的樣品集中起 來(lái)，以備酶活和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。（備注：具體操作步驟及上樣量以 ppt 課件為準(zhǔn)）試驗(yàn)a -淀粉酶的活性測(cè)定及比活計(jì)算1.1 試劑及設(shè)備3,5 二硝基水楊酸試劑 （DNS） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ 10mg/ml ） 福林試劑淀粉溶液（ 10mg/ml ） 磷酸鹽緩沖液（ pH6.0， 0.02M）722 型（或 721 型）分光光度計(jì)4 000r/min 的離心機(jī)分析天平1.2 原理與方法1.2.1 Fol in-酚試劑測(cè)定蛋白含量Foli n-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì) 銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（ Folin 試劑

14、）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡(jiǎn)便，靈敏度比雙縮脲 法高100倍，定量范圍為5100卩g蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱 氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白 質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。淀粉-55淀1.2.2 淀粉酶活性測(cè)定 淀粉是植物最主要的貯藏多糖， 也是人和動(dòng)物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用。淀粉酶主要包括a粉酶和B -淀粉酶兩種。a -淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的a-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥

15、芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。B-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解， 每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。 淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使 3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基 -5-硝基水楊酸，其反應(yīng)式如下：+ 坯棕棘3-氨吐巧十肖吐水暢護(hù) 1訃;兇.色淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于幾乎所有植物中，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子，淀粉酶活力最強(qiáng)，其中主要是a -淀粉酶和B -淀粉

16、酶。兩種淀粉酶特性不同，a-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。B -淀粉酶不耐熱，在70C 15min鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測(cè)定活力時(shí)鈍 化其中之一，就可測(cè)出另一種淀粉酶的活力。本實(shí)驗(yàn)采用加熱的方法鈍化B-淀粉酶，測(cè)出a -淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測(cè)定淀粉酶總活力（a-淀粉酶活力+ 3 -淀粉酶活力），再減去a -淀粉酶的活力，就可求出3-淀粉酶的活力。1.3試驗(yàn)部分1.3.1 Foli n-酚試劑測(cè)定蛋白含量（按 ppt課件為準(zhǔn)，以下僅供參考）1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作0.0250g結(jié)晶牛血清白蛋白，倒容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗100mL，（1）配制標(biāo)準(zhǔn)牛血清

17、白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL則配成250卩g/mL的牛血清白按表1加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清 然后各加試劑甲5mL，混 （這一步速度要快，否則會(huì)使數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 蛋白溶液。支普通試管,（2） 系列標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液的配制：取6白蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。 合后在室溫下放置10min，再各加0.5試劑乙，立即混合均勻 顯色程度減弱）。30min后，以不含蛋白質(zhì)的1號(hào)試管為對(duì)照，用722型分光光度計(jì)于 500- 650nm波長(zhǎng)下測(cè)定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以牛血清

18、白蛋白含量（卩g）為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。W1斗rn活e送閂拆帶苗線制作list刑1丄346giiiL牛血清白蛋白' 1也）00.2040X5o.s1.01.0OS060.401.20蚩口 質(zhì)fug）050ionISO?oc?so1.3.1.2樣品測(cè)定將各峰收集的樣品經(jīng)一定稀釋后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行測(cè)定。以緩沖液作為空白對(duì)照。1.3.2淀粉酶活性測(cè)定1.321標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取1.0%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0ml于50ml容量瓶中，用100、蒸餾水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200u

19、g的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按表 A1的操作步驟一起反應(yīng)。以葡萄糖含量為縱坐標(biāo)（0.5ml以上稀釋液葡萄糖含量分別為：200、300、400、500、600 口g）,以吸光值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程（Y= KX+B ）。1.3.2.2樣品測(cè)定在反應(yīng)過(guò)程中，從加入底物開(kāi)始,將各峰收集的樣品經(jīng)一定稀釋后按下表所示步驟操作，向每支管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致：表A1反應(yīng)順序樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白樣品稀釋液（ml）0.50.5一蒸餾水（ml）一一0.550C預(yù)熱 5minVVV依次加入淀粉溶液（ml）1.51.5 （第二步）1.5 （第二步）混合VVV50C保溫 30minV一一依次加入DNS試劑（ml）3.03.0 （