蛋白質(zhì)定量的五種方法

1、 蛋白質(zhì)定雖的五種方法 方法一雙縮月尿法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目的掌握雙縮脈法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 原理 雙縮脈NHCONHCONH堿性溶液中與硫酸銅反響生成紫紅色化合物，稱為 雙縮脈反響，蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵-CONH-在堿性溶液中也能與CiT反響 產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此， 可以利用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 雙縮脈法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的常用方法之一。 操作簡(jiǎn)便、迅速、受蛋白質(zhì)種 類性質(zhì)的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除 -CONH有此反響外， -CONHi -CH2NH、-CS-NH2等基團(tuán)也有此反響。 操作 取中試管7支，

2、按下表操作。 各管混勻、放置37C水浴中保溫20分鐘。用540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)， 讀取各管光密度值。 計(jì)算 一 在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 二 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測(cè)血活樣本的蛋白質(zhì)濃度 g /L,并求出人血活樣 本的蛋白質(zhì) 濃度。 三 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出人血活樣本的蛋 白質(zhì)濃度g / L。 器材 中試管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型 分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。 試劑 6N NaOH稱取240g氫氧化鈉溶于1000ml水中。 二雙縮脈試劑：稱取CuS0 5H2O 3.0克，灑石酸鉀9.0克和碘化

3、鉀5.0 克，分別溶解后混勻，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，貯于棕色瓶中， 避光，可長(zhǎng)期保存。如有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。 三 0.9 % NaCk 四 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液10mg/m1，稱取十燥的牛血活蛋白100.0mg,以少量生 理鹽水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗稱量瓶數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最后 加生理鹽水至刻度線，或用凱氏定氮法測(cè)定血活蛋白質(zhì)含量，然后稀釋成 l0mg / m1作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。 五待測(cè)血活樣本：將人血活或動(dòng)物血活用生理鹽水稀釋 10倍后再測(cè)定。 方案二 Folin-酚試劑法Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目的掌握Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理。

4、 原理 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 CuT螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物 使酚試劑的磷鉗酸復(fù)原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白 質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 操作 取試管7支、編號(hào)、按下表操作： 生理鹽水 生理鹽水 立即混勻，在20C 25C水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測(cè)定光密度值。 操作考前須知： 1. 按順序添加試劑 2. 試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下 試劑甲 易被破壞，因此加試劑乙 后要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙磷目酸在破壞前即被復(fù)原。 計(jì)算 一 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 二 以測(cè)定

5、管光密度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血活中蛋白質(zhì)濃度g /L。 三 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血活中蛋白 質(zhì)濃度g / L。 器材 一 721型分光光度計(jì) - 恒溫水浴箱 三中試管7支 四刻度吸管：1.0ml二支；0.5ml 一支；5.0ml 一支。 試劑 一試劑甲 1 4 %碳酸鈉Na2CO溶液 2 0.2N 氫氧化鈉溶液 3 1 %硫酸銅溶液CuSQ 54O 4 2 %灑石酸鉀鈉溶液或?yàn)⑹徕浕蜮c 在使用前1與2、3與4等體積混合，再將兩混合液按50: 1比例混合, 即為試劑甲。該試劑只能用一天，過(guò)期失效。 一試劑乙： 1 市售酚試劑在使用前用NaOH商定，以酚肽為

6、指標(biāo)劑，根據(jù)試劑酸度將 其稀釋，使最后酸度為1No 2 或取NaWo42HO l00g和NaMO 25g。溶于蒸僧水700ml中，再加85% HPO 50ml和HCl濃100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫和地回流 十小時(shí)，再加硫酸鋰Li 2SOHO150g,水50ml及漠水?dāng)?shù)滴。繼續(xù)沸騰15分鐘后 以除去剩余的漠，冷卻后稀釋至1000ml然后過(guò)濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色如帶 綠色者不能用，置于棕色瓶中保存，使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH商定，以酚猷為指示劑， 而后稀釋約一倍，使最后酸度為1No 三標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 用結(jié)晶牛血活白蛋白，根據(jù)其純度用蒸僻水配制成 0.25mg/ml的蛋白質(zhì)溶 液

7、。純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定。 四待測(cè)樣品：準(zhǔn)確取血活0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9 % NaCl 溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。 方案三 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目的:掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理， 熟悉紫外分光光度計(jì)的使 用。 原理 蛋白質(zhì)分子中含有共軟雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸 收紫外光的性質(zhì)，其吸收頂峰在280nm波長(zhǎng)處，且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰的光密度值 與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)，但由于各種蛋白質(zhì)的酪 氨酸和色氨酸的含量不同，故要準(zhǔn)確定量，必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品作為標(biāo)準(zhǔn) 來(lái)比擬，或且已經(jīng)知道

8、其消光系數(shù)作為參考。 另外，不少雜質(zhì)在280nm波長(zhǎng)下也 有一定吸收能力，可能發(fā)生十?dāng)_。其中尤以核酸喋吟和嚅噬堿的影響更為嚴(yán)重。 然而核酸的最大吸收峰是在260nm因此溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定 OD與OEUm。，然后根據(jù)兩種波長(zhǎng)的吸收度的比值，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式校正，以 消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。 本法操作簡(jiǎn)便迅速，且不消耗樣品可以回收，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量 測(cè)定。主要缺點(diǎn)：當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較 大時(shí)，那么產(chǎn)生一定誤差，混有核酸時(shí)必須分別測(cè)定280nmffi260nm兩處的ODfi, 再按公式推算蛋白質(zhì)含量。 操作 取試管7支，按下表操作

9、: 0.4 3.6 各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計(jì)，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，分別于 280nm 260nmK長(zhǎng)下測(cè)定各管光密度， 計(jì)算 一直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)液的光密度值。以80榆，或從標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本蛋 白質(zhì)含量。 以標(biāo)準(zhǔn)管各管光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 然后根 據(jù)測(cè)定管光密度值，直接查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本中蛋白質(zhì)的含量。 1. 選一種與待測(cè)樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似的蛋白質(zhì)純品，用生理鹽水稀釋 至濃度為lmg /ml,作為稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。 2. 用生理鹽水稀釋待測(cè)樣本蛋白質(zhì)至濃度約為 lmg/ml,即為稀釋樣本蛋白質(zhì) 溶液。 二利用經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算樣本蛋白質(zhì)

10、含量， 準(zhǔn)確吸取血活樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度， 即500倍稀釋，在280nmffi 260nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值、再按以下公式計(jì) 算。 1 、OD80/0D60 1.5 時(shí)，用 Lamber-Beer 定律計(jì)算： 樣本蛋白質(zhì)含量mm1 = OD280/KX L= OD80/6.3 X 1 X 10g/L 本實(shí)驗(yàn)樣品：牛血活白蛋白 E1%C嚀6.3 100ml/cm.g K:克分子消光系數(shù)；E1%Cm：白分比吸光度的吸光系數(shù)； 注：不同蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量有差異， 故標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管的蛋白質(zhì)氨 基酸組成應(yīng)相似，以減小誤差。 器材 一UV-9200紫外

11、分光光度計(jì) 二50ml容量瓶 試劑 一 生理鹽水 二 活蛋白人或牛純晶 三 待測(cè)樣本蛋白質(zhì)：用雙縮脈法測(cè)定蛋白質(zhì)的樣品用生理鹽水稀釋而成。 方案四考馬斯Comessie亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮蘭結(jié)合法是近年來(lái)開展起來(lái)的蛋白質(zhì)定量測(cè)定法。 本方法具有操作 方便、快速、十?dāng)_因素少的特點(diǎn)。 【原理】 考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合， 這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯 亮蘭G-250的最大光吸收峰在465nm當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)， 其最大 吸收峰改變?yōu)?95nm考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏性度。 在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭 G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈宵色。在595nmT,光

12、密 度與蛋白質(zhì) 含 量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 【操作】常量法 一 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備： 配制lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為 1000 g/ ml, 500 !i g/ml, 250 ii g/ml, 125 g/ml , 62.5 ii g/ml 和 31.25 ii g/ml。 按下表操作： 搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對(duì)照管，在721型分光光度計(jì)于波長(zhǎng) 595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度 g/ ml 作為橫座標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 二 未知樣品測(cè)定： 取血活0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻。

13、此法 樣品稀釋200倍。 取試管二只，按下表操作： 搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計(jì)亡波長(zhǎng)595nm比色，讀取光密度，查標(biāo) 準(zhǔn)曲線，求得稀釋樣品蛋白質(zhì)濃度。 【計(jì)算】 未知樣品蛋白質(zhì)濃度a g/ml=稀釋樣品濃度x稀釋倍數(shù) 【優(yōu)缺點(diǎn)】 操作簡(jiǎn)便、快速；檢測(cè)靈敏；重復(fù)性好。 二顯色迅速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在 l 小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。 三 與改進(jìn)Lowry氏法相比，十?dāng)_物質(zhì)較少。 四 當(dāng)樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉SDS、TritonX-100等去垢劑時(shí)， 顯色反響會(huì)受到十?dāng)_。如樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必須預(yù)先處理 樣品。 五 考馬斯亮蘭G250染液不

14、宜久存，以1-2月為宜。 六 微量法測(cè)定蛋白含量范圍為1-10從g；常量法測(cè)以檢測(cè)范圍10-100/從 g公宜。 【器材】 一試管l0支 二吸管 10ml、l5ml、lml、O.1ml 各 1 支。 三721分光光度法，普通比色杯4只。 【試劑】 一 O.9 % NaCl 二 待測(cè)血活 三 標(biāo)準(zhǔn)血活 四染液：考馬斯亮蘭G2500.1克溶于0.5 m195知醇。再參加100m185% WV磷酸。然后加蒸僻水定容到1000ml。此時(shí)溶液為0.0l %考馬斯亮蘭G250 /4.7 % W V/乙醇/ 8.5%MV磷酸。 方案五 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 【目的】：掌握BCAt測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理。 【

15、原理】： BCAbicinchonininc acid 與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑， 混合一起即成為蘋果綠，即BCS作試劑。在堿性條件下，BCM蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)， 蛋白質(zhì)將CiT復(fù)原為CL+, 一個(gè)CL+螯合二個(gè)BC子,工作試劑由原來(lái)的蘋果綠 形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。 【操作】 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取試管七支、編號(hào) 【計(jì)算】 一 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 二 以測(cè)定管吸光度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血活中蛋白質(zhì)濃度g/L 三 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血活中蛋 白質(zhì)濃度g/L。 【優(yōu)缺點(diǎn)】 一 操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方 便； 二 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA式劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200 g/ml , 微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10 g/ml。 三 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用 量； 四 抗試劑十?dāng)_能力比擬強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響。 【器材】 一 7220型分光光度計(jì) 二 恒溫水浴箱 三 中試管7支 四 槍式移液管 【試劑】 1、試劑A: 1 % BCAT鈉鹽 2 %無(wú)水碳酸鈉 0.16% 灑石酸鈉 0.4 %氫氧化鈉 混合調(diào)PH值至11.25 2、 試劑B