Lowry’s法Folin酚試劑法測定血清中蛋白質(zhì)的含量ppt課件

1、怎樣測定血清中蛋白質(zhì)的含量怎樣測定血清中蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)含量測定的常用方法比較蛋白質(zhì)含量測定的常用方法比較方方 法法 靈敏度靈敏度 優(yōu)點優(yōu)點 缺點缺點凱氏定氮法凱氏定氮法0.2 1.0mg 干擾少，干擾少， 準(zhǔn)確準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費時操作復(fù)雜，費時 紫外吸收法紫外吸收法50100mg 快速簡便快速簡便無損樣品無損樣品靈敏度低靈敏度低干擾物較多干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）法）15ug 靈敏、簡靈敏、簡便、快速便、快速不同蛋白質(zhì)測定時不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差有較大的偏差 雙縮脲法雙縮脲法 120mg 干擾相對干擾相對少，較快少，較快靈敏度低靈敏度低選擇測定方法時應(yīng)考慮

2、：選擇測定方法時應(yīng)考慮：l1、實驗樣品對測定所要求的靈敏度和精確度；l2、蛋白質(zhì)的性質(zhì)；l3、溶液中存在的干擾物質(zhì)；l4、測定所花費的時間等。Lowrys法法Folin-酚試劑法測酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量定蛋白質(zhì)含量Determination of protein content by Lowrys method實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膌1、掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理 l 及其實驗操作技術(shù)。l2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線l 求樣品溶液中待測物質(zhì)含量的方法 。原理原理 1921年，F(xiàn)olin 首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基酚基還原酚試劑磷鎢酸-磷鉬酸起藍(lán)色反應(yīng)。 1

3、951年，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先在標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。原理原理l第一步：雙縮脲反應(yīng)第一步：雙縮脲反應(yīng)l 在堿性溶液中在堿性溶液中,雙縮脲雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與能與Cu2+作用作用,形成紫色或紫紅色的形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物絡(luò)合物,這個反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白這個反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個肽鍵質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個肽鍵, 因此有雙縮脲反應(yīng)。因此有雙縮脲反應(yīng)。l 即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋作用生

4、成紫紅色的蛋白質(zhì)白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物。復(fù)合物。原理原理l第二步：第二步：Folin-Folin-酚顯色反應(yīng)酚顯色反應(yīng)l Folin-Folin-酚試劑在堿性條件下極不酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽- -磷鎢酸鹽易被酚類化合物磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)還原而呈藍(lán)色反應(yīng)( (鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物) )。由。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸(Tyr) (Tyr) ，故，故有此顯色反應(yīng)。有此顯色反應(yīng)。l 即蛋白質(zhì)即蛋白質(zhì)- Cu2+- Cu2+復(fù)合物中所含的酪復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷氨酸

5、或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。 在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。 即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。原理原理樣品樣品l健康人血清l正常人血清蛋白質(zhì)含量：6080g/L試劑試劑l1、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液200g/ml）l2、堿性硫酸銅溶液當(dāng)日有效）l3、Folin-酚試劑儀器和器材儀器和器材l1、V-1100分光光度計l2、恒溫水浴箱l3、試管6支、試管架l4、加樣槍、加樣槍架l5、刻度吸管l6、坐標(biāo)紙操作操作l各管混勻，室溫放置各管混勻，室溫放置10m

6、in。 l向各管內(nèi)加入向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑酚試劑0.20mL, 2s內(nèi)迅速混勻！內(nèi)迅速混勻！ 40放置放置10min。l冷卻至室溫后，以冷卻至室溫后，以500nm波長比色，用波長比色，用1號管作空白，讀取各管吸光度。號管作空白，讀取各管吸光度。試劑試劑 （ml)123456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液-0.200.400.600.80-樣品液（稀釋樣品液（稀釋300倍）倍）-0.50蒸餾水蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅堿性硫酸銅2.02.02.02.02.02.0蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（g/ml）04080120160？本卷須知本卷須知lFol

7、in-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。l故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。本卷須知本卷須知l因因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。l即第即第1支試管加入支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計時，堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1分鐘后，第分鐘后，第2支支試管加入試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第分鐘后加第3支試管，以此類推。

8、支試管，以此類推。l全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第分鐘，則第1支試管可立即加入支試管可立即加入0.20mL Folin-酚試劑，酚試劑，1分鐘后第分鐘后第2支試管加入支試管加入0.20mL Folin-酚試劑，酚試劑，2分鐘后加第分鐘后加第3支試管，以此類推。支試管，以此類推。l水浴水浴10min，流水冷卻后，每，流水冷卻后，每1分鐘拿出一管，測吸光值。分鐘拿出一管，測吸光值。蛋白樣品蛋白樣品堿性銅試劑堿性銅試劑混勻，混勻，放放10min加酚試劑加酚試劑2s混勻混勻水浴水浴10min放至放至室溫室溫比色比色數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理測定次數(shù)各管A值2

9、3 4 5 6 待測樣品管7123各管平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟l1、選擇合適的坐標(biāo)紙l2、畫坐標(biāo)軸l3、根據(jù)測得的數(shù)據(jù)描點l4、連線l5、求實驗結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線l以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度Cg/ml）0.20.40.6.4080120160繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線l要求：l 根據(jù)所描點的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實驗點的平均變動情況，因此該線不需全部通過各點，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實驗點均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。計算計算l根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的

10、蛋白質(zhì)含量。l然后乘以稀釋倍數(shù)300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(g/ml)。l血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度2300為什么？為什么？本方法的特點：本方法的特點：l優(yōu)點：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍；l 2.操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備。l缺陷：1.操作時間較長，要精確控制操作時間；l 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式；l 3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。 復(fù)習(xí)思考題復(fù)習(xí)思考題l1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點？l2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？l l 請將答案附在實驗報告上！V-1100分光光度計操作步驟分光光度計操作步驟l開機(jī)，預(yù)熱開機(jī)，預(yù)熱30分鐘；分鐘；l轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)所需波長。按轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)所需波長。按 鍵切換到鍵切換到T檔；檔；l將黑體放入光路中，合上蓋，按將黑體放入光路中，合上蓋，按 鍵校零；鍵校零；l開蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測液的順序放入比色杯架上，合開蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測液的順序放入比色杯架上，合上蓋，按上蓋，按 鍵切換到鍵切換到A檔檔 ；l拉動比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按拉動比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按 鍵校零；鍵校零；l拉動拉桿，將標(biāo)準(zhǔn)液、待測液依次放入光路中拉動拉桿，將標(biāo)準(zhǔn)